[发明专利]基因分型的方法

说明书

本申请是中国专利申请201080061597.0的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因分型的方法，特别涉及被分配给各基因型的ID序列，以及使用所述ID序列的多重基因分型方法。

背景技术

已开发的检测感染性生物体的方法包括传统的通过培养来鉴别病原体的物理和化学特征的方法，以及检测病原体的特定遗传特征的方法。遗传特征的检测方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)分析、扩增片段长度多态性(AFLP)分析、脉冲场凝胶电泳、任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)技术，基于重复序列的PCR，核糖分型和比较核酸测序。这些方法用于大多数诊断设置通常显得过于缓慢、昂贵、不可重复，并且技术要求高。所有上述方法一般都需要：使用繁琐的凝胶电泳步骤、病原体在培养过程中的生长、其基因组的DNA纯化，以及样本不包含多于一种类型的生物体。这些限制也存在于最近开发的采用高密度微阵列的检测方法(Salazar et al.,Nucleic Acids Res.24:5056-5057,1996；Troesch et al.,J.Clin.Microbiol.37:49-55,1999；Lashkari et al.,Proc.Natil.Acad.Sci.U.S.A.94:13057-13062,1997)。与此同时，焦磷酸测序是一种基于“通过DNA合成测序”原则的DNA测序方法，它不同于传统的Sanger测序方法，而是依赖于检测核苷酸插入过程中释放的焦磷酸。在焦磷酸测序法中，在聚合过程中顺序地逐一添加四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)。与通过酶促反应被聚合的dNTPs结合的PPi发出光，并且发出的光根据顺序地添加的dNTPs的反应顺序而显示出信号峰，峰显示出与反应的dNTPs的数目成比例的多或者少的模式，这样能够确定病原体的核苷酸序列。近年来，已经使用了对病原体特异序列的PCR产物进行焦磷酸测序，基于由此获得的热裂解谱图(pyrogram)对临床标本中的病原细菌或病毒进行检测的方法(Travasso,CM et al,J.Biosci.,33:73-80,2008；Gharizadeh,B et al.,Molecular and Cellular Probes,20,230-238,2006；Hoffmann,C et al.,Nucleic Acid Research,1-8,2007)。

然而，在上述焦磷酸测序技术中，核苷酸测序是根据dNTPs的分配顺序来进行，并且在模版中的不处于分配顺序中的核苷酸不会参加反应，因此不会形成信号峰。然而，当在所述分配顺序中相同的核苷酸持续出现时，根据所发射出的光的强度而确定信号峰的高度。因此，当多种病原体存在于同一样品中，不同病原体核苷酸的信号峰将出现重叠，因此，这使通过解释热裂解谱图来鉴定病原体变得困难。特别是随着重复序列数目增加时，前面序列的信号峰变得相对较低。因此，在多种病原体感染的情况下，根据每种病原体的感染程度来检测信号峰变得困难。

因此，本发明付出大量的努力，使得能通过利用焦磷酸测序进行基因分型获得的独特且简单的热裂解谱图来获得所感兴趣的基因型。结果，本发明发明者发现，当ID序列含有ID标记、标志物和终止标记，同时所述ID序列独立存在于需要进行分型的特异性序列之外时，将所述ID序列与该特异性序列接连并用于进行焦磷酸测序，将获得针对于每种基因型的独特且简单的热裂解谱图，从而完成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种ID序列，所述ID序列可用于进行焦磷酸测序，以便能通过独特、简单的热裂解谱图确定感兴趣的基因型。

本发明的另一个目的是提供使用所述ID序列的基因分型方法。

本发明又另一个目的是提供使用所述ID序列对HPV基因分型的方法。

本发明再另一目的是提供使用所述ID序列检测KRAS基因突变的方法。

本发明又一目的是提供使用所述ID序列检测呼吸道病毒的方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于基因分型的ID序列，其由A(ID-S)n-E组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸；E是终止标记，其是不同于所述标志物的核苷酸，并且n是从1到32的自然数。

本发明还提供一种用于基因分型的ID序列，由ID-S组成，其中ID是ID标记，是选自A、T、C和G的单核苷酸；并且S是标志物，其是与相邻的ID标记连接，且不同于相邻的ID标记的核苷酸。