[发明专利]一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法。

背景技术

n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，以下简称PUFAs)是细胞膜的重要组成部分，在人类很多疾病的预防和控制方面发挥重要作用。但是对哺乳动物来说，由于其体内缺少能够将n-6PUFAs转化为n-3PUFAs的脂肪酸脱氢酶，因此不能内源性合成，但是日益成熟的转基因技术使得生产出自身合成n-3PUFAs的转基因动物成为可能。但是转基因技术本身可能会给转基因动物带来一定的负面影响，例如，细胞衰老等。因此，如果要鉴定转入的外源基因对细胞衰老等方面的影响，必须排除转基因技术本身带来的影响。

含有两个或者或两个以上双键的脂肪酸通常被称为多不饱和脂肪酸(PUFA)。脂肪酸是脂肪的重要组成成分。长链多不饱和脂肪酸通常分为n-3(ω-3)和n-6(ω-6)两类。这两类脂肪的代谢和功能不同，且往往具有相反的生理功能，往往是具有相反功能的信号分子的前体分子。众所周知，n-3多不饱和脂肪酸对人类健康是大有裨益的，它作为细胞膜的重要组成部分，可以抑制多种肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。但是n-6多不饱和脂肪酸对细胞具有相反的作用，n-6多不饱和脂肪酸的过度摄入可以引起炎症和心血管疾病病。因此，提高n-3多不饱和脂肪酸的摄入量是非常重要的。研究表明：饮

食中n-6和n-3多不饱和脂肪酸的的比值接近3∶1或者4∶1时，对健康有益。但是由于动物性食品的过多摄入及鱼油等的过低摄入导致目前饮食中n-6和n-3的比例过高。因为哺乳动物细胞缺乏自身合成n-3多不饱和脂肪酸和将n-6多不饱和脂肪酸转化为n-3多不饱和脂肪酸的酶，n-3多不饱和脂肪酸必须依靠膳食补充剂。

为了满足日益增长的人口对n-3多不饱和脂肪酸需求，必须发展一种可持续的n-3多不饱和脂肪酸资源。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法，包括如下步骤：

S1、根据GenBank中的的线虫序列(ACCESSION NM_001028389)，采用化学合成法合成针对哺乳动物进行过密码子优化的FatI基因的编码区序列，并在起始密码子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表达的Kozak序列，并在其上下游分别引入了HindIII，KpnI限制性内切酶的酶切位点及相应的保护碱基；

S2、将步骤S1合成的序列连接到克隆载体pUC57载体中，获得重组质粒pUC57-FatI，将pUC57-FatI和真核表达载体pCDNA3.1(+)用限制性内切酶HindIII，KpnI进行双酶切，胶回收相应的片段，将FatI基因连接入将连接入真核表达载体pCDNA3.1(+)中获得重组质粒pCDNA3.1(+)-FatI；由于pCDNA3.1(+)-FatI上具有2个SalI酶切位点，将经过质粒抽提获得的pCDNA3.1(+)-FatI用SalI酶切后胶回收相对大的片段，以备转染。

S3、取怀孕35天的波尔山羊，手术迅速取出山羊胎儿，用含双抗的PBS冲洗2遍，在超净工作台上将山羊胎儿去头去尾去内脏，剩下的部分用剪刀剪碎后加胰酶消化30min，用移液器吹打至大部分为单个细胞，将所得的细胞置于添加有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/L硫酸链霉素的DMEM/F12培养基上，5％CO₂培养箱中37℃培养；

S4、当步骤S3中细胞汇合度达到85％左右时，用胰酶消化收集步骤S3所得的细胞，并用PBS冲洗2次，以彻底去掉胰酶，用无抗生素的细胞培养基稀释细胞，加入经过酶切回收的带有FatI基因的DNA，混合后冰浴10min，用电穿孔仪ECM830进行电转染；取出电击杯，冰浴10min后，将细胞转移至培养皿中在37℃，5％CO2环境的培养箱中培养；细胞培养至24小时后加G418，进行抗性筛选；

S5、经过11天的培养筛选，培养皿中开始出现阳性克隆，将阳性克隆挑出后培养于96孔板中，然后逐级放大到24孔板和6孔板中，得到稳定表达促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的FatI基因序列的细胞株；