[发明专利]一种二化螟Bt蛋白受体ALP5基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种新的二化螟Bt蛋白受体ALP5基因及其应用，本发明还涉及一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法。

背景技术

二化螟属鳞翅目，螟蛾科，是水稻上危害最为严重的常发性害虫，国内各稻区均有分布，以长江流域及以南稻区发生较重，近年来数量呈明显上升的态势，给农业生产造成严重威胁。

苏云金芽孢杆菌Bacillus thurihgiehsis，简称Bt，属于芽孢杆菌科Bacillaceae芽孢杆菌属Bacillus，是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中。自上世纪30年代以来，Bt即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防治，Cry1Ac、Cry2Aa均为Bt中的杀虫蛋白。

ALP(alkaline phosphatase,碱性磷酸酶)在鞘翅目、双翅目与鳞翅目昆虫中被鉴定为Bt毒素受体。ALP在生物体中分布广泛，在昆虫体内主要分布在中肠中，是一类具有催化磷酸基团的转移反应和磷酸单酯水解反应活性的非特异性的水解酶。此类酶具有高度的保守性，与氨肽酶特性相似，都能够被糖基化的磷脂酰肌醇GPI锚定在细胞膜表面。另外，ALP表达量下降与昆虫对Bt杀虫蛋白的抗性密切相关，抗性品系中ALP活性约为敏感品系的30％。

随着转Bt基因作物种植规模的逐步扩大，昆虫对Bt产生抗性的风险也日益增加。目前国内外的许多研究已证明鳞翅目、鞘翅目和双翅目的多种昆虫经过室内汰选后可以对不同的Bt蛋白产生抗性。Bt杀虫蛋白对害虫的作用机理是研究防止抗性形成的基础，因此为了制定和实施合理的抗性治理策略，实现转Bt作物的可持续利用，研究昆虫对Bt产生抗性的机理就显得尤为重要。

二化螟对Bt杀虫蛋白的抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：二化螟的Bt生物测定结果一般需要2天(48小时)以上；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约200头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高；(4)操作麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫的大小一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(5)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC₅₀和LC₉₀值的重复性和精确性较低；(6)传统的生物测定方法测得的昆虫抗性水平往往具有滞后性。因此，建立一种准确、简便、快速、可靠的二化螟Bt抗性检测手段尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种二化螟Bt蛋白受体ALP5基因，并进一步提供所述基因在检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的二化螟Bt蛋白受体ALP5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步，本发明将ALP5基因通过构建原核表达载体获得了重组ALP5蛋白，并研究了重组ALP5蛋白与Bt杀虫蛋白的结合能力，结果发现该重组蛋白能与Bt杀虫蛋白特异性结合，从而验证了ALP5基因的功能。

在此基础上，提供了一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，它包括以下步骤：

1)二化螟总基因组DNA的提取；

2)设计特异性引物，按常规方法进行PCR扩增、纯化、测序；

3)将测序结果与所述的二化螟Bt蛋白受体ALP5基因序列进行对比，检查回收得到的DNA是否出现突变位点；

所述特异性引物为：

上游引物序列为ATGAAATCTAATTTTAATCTAAGCAGGAC；

下游引物序列为TACCTTGCAATACGTGAATCCAG。

本发明的有益效果是：

1)与传统的二化螟对Bt杀虫蛋白抗性检测方法相比，本发明所提供的方法无需将田间试虫饲养至适宜虫龄后再进行测定以确定抗性水平，而是直接从田间采样测试，不需饲养试虫，从而减少了中间过程，缩短了检测周期，节省了劳动力和资源。

2)本发明具有检测速度快，检测结果准确可靠，检测灵敏度和精度高，检测所需的试虫数量少，能实现真正的标准化操作，为二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的实时监测提供了一种新方法，进一步为二化螟虫害的有效治理提供了重要参考。

附图说明