[发明专利]用于使用吡哆醛5’-磷酸-依赖性酶的改良高半胱氨酸测定法的N,N-二丁基-对-苯二胺与吡哆醛5’-磷酸的SCHIFF碱缀合物

说明书

技术领域

下文涉及用于定量测定血浆或血清中总高半胱氨酸的量及基于测量得到的总高半胱氨酸存在量来评估疾病风险的组合物、方法和试剂盒。更具体地说，下文公开了涉及利用高半胱氨酸酶及N,N-二丁基-对-苯二胺与吡哆醛5’磷酸的Schiff碱缀合物的二试剂酶促高半胱氨酸测定法的实施方案。

背景技术

心血管疾病在美国具有最高的死亡率，每年引起一百万例心脏病发作和中风死亡。越来越多的研究报告了正是总高半胱氨酸(tHCY)在心脏病和中风，以及众多其它疾病中发挥至关重要作用。高同型半胱氨酸血症是末期肾病(ESRD)患者中的心血管疾病死亡的一项主要风险因子，而且血浆tHCY可作为新肿瘤标志物用于在化疗期间监测癌症患者。已经报告了阿尔茨海默氏病患者和糖尿病个体可具有显著升高的血浆tHCY。在其它疾病诸如帕金森氏病中，高半胱氨酸可能发挥作用导致多巴胺能神经元易于功能障碍和死亡。tHCY的浓度还可能与常见的妊娠并发症和不利妊娠结局有关。测量tHCY水平通常可帮助内科医师在妊娠过程中监测胎儿和母亲的健康。

已经开发了多种方法来测量血浆中的总高半胱氨酸(tHCY)。这些多种方法包括为Abbott IMx分析仪设计的tHCY酶转换免疫学测定法、微量滴定板tHCY酶促免疫测定法、使用多种酶的高效液体层析(HPLC)方法测定法、和气体层析-质谱术方法。然而，这些方法复杂，实施要求高度专门化的设备，而且通量有限。虽然已经开发了不要求前述方法的专门化设备的更简单的四试剂单酶测定法，但是该四试剂测定法仍然比本文中公开的测定法更加复杂。该四试剂测定法包括额外的试剂和步骤来测量tHCY。该四试剂方法更加昂贵，要求更多时间来提供准确读数，而且不适用于当前使用的大多数自动化机器人分析仪。因此，需要比先前方法更简单、更便宜、更快速、且更容易实施的能测量tHCY量的tHCY测定法。

发明内容

本公开文本的一个实施方案涉及一种测量总高半胱氨酸的方法，其包括下述步骤：提供高半胱氨酸，用还原剂还原该高半胱氨酸，用高半胱氨酸酶(HCY酶)使该高半胱氨酸发生酶促反应，生成硫化氢(H₂S)，提供N,N-二丁基-对-苯二胺-吡哆醛5’-磷酸(N,N-dibutyl-p-phenylenediamine-pyridoxal 5’-phosphate)(DBPDA-PLP Schiff碱)，在含Fe(III)化合物存在下将自该Schiff碱释放的DBPDA-PLP与所述H₂S组合，生成至少一种生色团，并用分光光度计或荧光读数仪(荧光计)测量该至少一种生色团。

本公开文本的另一个实施方案涉及一种生成N,N-二丁基-对-苯二胺-吡哆醛5’-磷酸的方法，其包括下述步骤：提供N,N-二丁基-对-苯二胺(DBPDA)在无水醇(anhydrous alcohol)中的溶液，混合该溶液与吡哆醛5’-磷酸(PLP)溶液，生成混合物，通过将该混合物的pH调节至大约4而形成沉淀物，并离心该沉淀物。

本公开文本的又一个实施方案涉及一种生成N,N-二丁基-对-苯二胺-吡哆醛5’-磷酸的备选方法，其包括下述步骤：提供N,N-二丁基-对-苯二胺(DBPDA)在无水醇中的溶液，将该溶液添加至吡哆醛5’-磷酸(pyridoxal 5’-phosphate)(PLP)溶液，生成混合物，并结晶该混合物。

本公开文本的一个实施方案涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括：第一试剂，该第一试剂包括还原剂、高半胱氨酸酶(HCY酶)与N,N-二丁基-对-苯二胺-吡哆醛5’-磷酸的混合物；第二试剂，该第二试剂包括含Fe(III)化合物；第一缓冲溶液；和第二缓冲溶液。

本公开文本的另一个实施方案涉及一种用于检测总高半胱氨酸(tHCY)依赖性的不良状况(total homocysteine dependent adverse condition)的风险的方法，该方法包括下述步骤：自患者提取含高半胱氨酸的血浆或血清，用还原剂还原结合的高半胱氨酸，用高半胱氨酸酶(HCY酶)使该高半胱氨酸发生酶促反应，生成硫化氢(H₂S)，提供N,N-二丁基-对-苯二胺-吡哆醛5’-磷酸(DBPDA-PLP Schiff碱)，在含Fe(III)化合物存在下将自该Schiff碱释放的DBPDA与所述H₂S组合，生成至少一种生色团，并用分光光度计测量该至少一种生色团。