[发明专利]一种快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术领域，特别是涉及一种用分子生物技术快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法。

背景技术

桑椹缩小型菌核病的经济重要性. 桑椹缩小型菌核病(shrunken-fruitsclerotiniose of mulberry)是三种桑椹菌核病之一，其病原菌为核地杖菌(Scleromitrula shiraiana) (Schuamacher T, Holst-Jensen A. A synopsis of the genus Scleromitrula. Mycoscience, 1997, 38(1): 55-69)，是世界上发生最普遍和危害最严重的桑椹菌核病。该病在我国发生非常普遍，江苏、浙江、上海、四川、重庆、陕西和台湾等主要果桑种植区均有发生分布，发病率常年均可达到30%—60%，一般减产20%—50%；近几年来在许多地区桑菌核病爆发流行，造成大面积果桑毁产绝收(蒯元璋, 吴福安. 桑椹菌核病病原及病害防治技术综述. 蚕业科学, 2012, 38(6): 1099-1104)。因此，桑椹菌核病是危害果桑作物的重要病害，是影响桑树生长发育和桑椹产量的重要限制因子，研究该病害的诊断鉴定技术，以准确地预测和有效地防治病害流行，对于桑果生产稳定发展具有重要意义。

桑椹缩小型菌核病发生诊断的重要性. 桑菌核病菌以掉落在桑园土壤中的菌核越冬，次年春季气温升高后开始萌发产生子囊盘(蘑菇)，形成大量子囊孢子散发于空气中，在桑树开花期侵染花朵，果实成熟时表现症状，将桑椹的部分或全部小果粒变为菌核。缩小型菌核病椹显著缩小，灰白色，质地坚硬，表面有暗褐色细斑，病椹内形成黑色坚硬菌核。桑椹菌核病从病原菌侵染到桑果大量发病的时间历程很短，病害的快速准确诊断和早期预报是指导生产中病害防治的关键。

桑椹缩小型菌核病快捷准确诊断技术的必要性. 目前，桑椹菌核病的诊断主要采用传统病害诊断方法，即根据症状和病原菌形态确定病害的种类。但是，传统的病害诊断需要病害表现出症状之后才能进行，而且需要分离得到病原菌的纯培养和对病原菌进行显微特征观察。一方面，病原菌的分离纯化过程相当复杂，实验条件和技术要求都较高，诊断的准确性和可靠性难以保证；且在人工培养条件下病菌生长缓慢，一般需要15—20天之后才能观察鉴定，获得诊断鉴定结果；另一方面，病害一旦开始显症，就会迅速发展，此时做出诊断为时已晚，根据诊断结果采取防治措施已不能获得有效的病害防治效果。因此急需一种快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法。

桑椹缩小型菌核病分子诊断技术尚未建立. 传统的真菌分类和鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等，这种方法耗时长、灵敏度低以及经验性强，从发病的植株中分离和鉴定病原菌需要很长时间，难以适应现代农业生产中病害预测和综合防控实践的需要。随着分子生物学的发展，各种分子技术应用到植物病原物的检测，唐建辉等(2006)利用RAPD技术转化为SCAR标记，设计引物RB/RC对西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare进行特异性检测。Qin et al(2010)应用巢式PCR技术，根据ITS序列，设计出引物XJJ21/XJJ222对引起油菜菌核病的Sclerotinia sclerotiorum进行特异性检测。Zhang et al (2014)建立了水稻黑条欸缩病毒病的实时PCR定量检测技术。总之，目前分子生物技术在植物病害诊断鉴定领域已经广泛应用，不少重要的植物病害的分子检测技术都已建立。但迄今为止，国内外还未见有关核地杖菌DNA特异保守序列(或基因)的发现及桑椹缩小型菌核病分子快捷诊断鉴定方法的研究报道。

发明内容

 本发明的目的在于提供一种快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法。申请人通过研究桑椹菌核病病原核地杖菌DNA，筛选出适合的基因CS23进行RAPD扩增，获得了590bp的核地杖菌特异性保守序列(SCAR序列，见序列表及实施例)，由此设计和筛选出一对能有效扩增该保守序列的特异性SCAR引物(SSF/SSR)，再通过几个重要PCR因子的优化，建立了核地杖菌的SCAR-PCR体系和技术，测试明确技术的灵敏度，并通过桑园采集的田间样品测试检验技术的实用性和可靠性。

本发明所述的一种用分子生物技术快速诊断桑椹缩小型菌核病的方法，通过以下步骤实现：

(1) 取待测样品，采用CTAB方法从样品中提取总DNA；