[发明专利]用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法

说明书

技术领域

 本发明属于蛋白质顺磁标记领域，特别是一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法。

背景技术

近年来，高分辨顺磁核磁共振在生物大分子等结构生物学的研究中发挥的作用日益重要。此技术通过顺磁中心的未配对电子与蛋白质分子自旋核的相互作用来提供丰富的长程结构限制信息，如顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement，PRE）、贋接触化学位移（pseudocontact shifts，PCS）、残余偶极耦合（residual dipolar couplings，RDC)，利用这些顺磁信息，我们可以进一步研究生物大分子的空间结构、生物功能以及分子之间的相互作用（(a) J. Biomol. NMR, 2010, 46: 101-112. (b) Annu Rev Biophys,2010, 39: 387-405. (c) Chem Rev, 2009, 109(9): 4108-4139. (d) Prog NMR Spectr,2002, 40: 249-273）。

由于大多数蛋白质没有顺磁中心，为获得上述顺磁信息就需要借助合适的双功能顺磁探针，并通过与蛋白质定点连接来实现。连接后，由于顺磁效应，顺磁中心附近氨基酸残基的化学环境会发生较大的变化，导致核磁共振谱峰的化学位移亦发生明显改变，进而得到PCS、PRE或RDC等相关顺磁数据。由此看来，双功能顺磁探针的设计与合成在蛋白质顺磁研究中尤为重要（Chinese J Magn Reson,2014, 31(2), 155-171）。

通过有机化学手段合成的双功能顺磁探针通常由以下两个不同的单元构成：1）一个具有很强金属离子螯合性能的基团；2）一个可与蛋白质定点连接的活性反应基团。前者可以螯合具有不同顺磁物理特性的金属离子（如镧系金属离子，过渡金属离子），即顺磁中心；后者与蛋白质上唯一的活性氨基酸残基（如半胱氨酸、非天然氨基酸）反应，可达到对蛋白质定点选择性标记的目的，从而进一步用于蛋白质顺磁研究。

为获得良好的顺磁数据，在设计探针时，含有多氨基多羧基的螯合配体常被用作为理想顺磁探针的基本骨架。从探针的骨架结构出发，又可将其划分为两大类，一类以非环状结构的乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N′,N′-四乙酸（PyMTA）等衍生物为主，另一类以环状结构的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）等衍生物为主，这些探针均可与顺磁金属离子配位形成热力学稳定的配合物。图1中列出了已报道的部分代表性的顺磁探针。

Gaponenko等人（J. Biomol. NMR, 2002, 24: 143–148）将已商业化的EDTA系列探针，即图1中的化合物L-1，通过活化巯基的方法定点标记到目标蛋白质。其中，EDTA作为配位化学中应用广泛的有机螯合配体，可与金属离子稳定结合。他们使用此探针在滴加Co²⁺和Yb³⁺后，成功获得了PCS和RDC数据，并得到溶液中对称二聚体蛋白质中每个单体的结构信息。

Prudêncio等人（Chem. Eur. J., 2004, 10: 3252–3260）报道了DTPA系列探针，即图1的化合物L-2，此类探针具有8个螯合位点且与顺磁金属离子形成非常稳定的配合物。此外，它包含两个活性巯基，由DTPA双酸酐与S-(2-氨乙基)甲基硫代磺酸反应得到，可以和目标蛋白质上距离8~10?的两个半胱氨酸残基同时反应，生成两个二硫键，从而增强了探针的刚性，限制了探针与蛋白质间的相对运动，避免了PCS平均化，但两个半胱氨酸残基的位置需仔细斟酌，含有多个半胱氨酸的蛋白质在表达和纯化过程中也有可能二聚或沉淀。在与蛋白质连接，滴加顺磁金属离子后，其NMR谱图至少有5套信号峰，HSQC谱图非常复杂，难于分析。故此探针常用于获得PRE作为限制条件来研究蛋白质结构。