[发明专利]一种单通道双浓度梯度微流控芯片的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微流控技术领域、药物筛选领域及生物检测领域，具体涉及一种可在单通道实现氧气浓度和化学浓度双梯度的微流控芯片。

背景技术

目前，大部分药物筛选的考察方法忽略了肿瘤细胞在体内所处的缺氧微环境，由于细胞的生长状态与其在体内的微环境差异很大，因而药效测试准确度不高，且受体内诸多因素制约。在人类的各种癌症中，实体瘤占了大于90％的比例，实体瘤内部存在的一部分的细胞处在缺氧或者无氧的微环境下，处于缺氧微环境下的肿瘤细胞对化学药物的治疗有抵抗性，这不仅仅是因为处于缺氧情况下的细胞本身对大多数抗肿瘤药物具有抗性，更因为缺氧的细胞位于肿瘤内离血管最远的地方，而且抗肿瘤的化学药物一般是通过血管扩散到细胞的周围，因为离血管较远的缺氧肿瘤细胞能够接收到的抗肿瘤药物比离血管较近的细胞少的多，导致缺氧微环境下化学抗肿瘤药物对肿瘤细胞药物毒性作用较弱。因此，肿瘤药物的筛选要结合肿瘤细胞所处的缺氧微环境，才能更好的发挥药效。实体瘤细胞不但处在低氧的微环境，而且微环境的氧气浓度并不是均一的，而是以浓度梯度的方式存在的。因此，在肿瘤药物筛选时，考察肿瘤药物在不同氧气浓度下的药效，可为抗癌药物的研发提供理论依据。

传统的方法在体外制造低氧浓度是通过将培养液与特定氧浓度气体进行交换来实现，但是这种物理方法需要很多设备的辅助，例如氧气罐和气体混合装置。用氯化钴、硫代硫酸钠等化学除氧物质也可以实现低氧，同时会伴随有重金属毒性和有毒副产品的产生。

近年来，微流控芯片以能够更好地模拟体内环境以及多功能集成等特点逐渐成为一种新兴的研究平台。目前，基于微流控芯片技术来产生氧浓度梯度的方法已经有了报道。最简单的方法是将用于细胞培养的微流控芯片装置置于细胞培养箱中，通过调节细胞培养箱中氧气的浓度实现缺氧环境，但整个芯片通道中的氧浓度均一，不能实现氧气浓度梯度；另一种方法是通过细胞自身呼吸在管道内产生氧浓度梯度，利用微流控芯片的设计，在一定操作环境下调节芯片内细胞培养的自分泌和旁分泌代谢物，在芯片的轴向形成氧浓度梯度，但是这种方法也有不足之处，产生的氧浓度梯度仅仅只能在沿管道轴向的方向，而且不能产生非常低的氧浓度和高氧浓度。最普遍的方法是利用PDMS良好的透气性，在芯片上集成不同浓度气体通道，不仅可以实现细胞培养通道和气体控制通道的分割，而且可以有效快速地实现气体的交换，进而形成氧气浓度梯度。这种方法存在的缺限是，芯片结构较复杂，需要两层或者三层，制作较麻烦，需要外接气瓶并对其精确控制，操作复杂。现在，利用一些缺氧试剂实现氧气浓度梯度，这种方法很好地简化了芯片的复杂程度，操作也更加简单方便，但化学试剂都是有细胞毒性的，对其生物相容性有很严格的要求，对细胞的活性有影响。更为重要的是，目前现有的这些方法都只能实现氧浓度梯度这一种类型的浓度梯度。

生物分子的浓度梯度在许多生物过程中发挥着重要作用，包括细胞增殖、炎症和伤口的愈合以及肿瘤转移等。体外研究这些生理现象，就需要模仿生物体内这种可控的、可以量化的浓度梯度。微流控技术是研究生物体内化学浓度梯度比较有前景的技术，其可以通过控制对流与扩散的传输过程使生化分子在时间和空间上分布产生化学浓度梯度。但是，目前的微流控浓度梯度发生器，仍然有许多不足的地方，例如不能再现细胞在体内的空间和时间的动态梯度，形成梯度的跨度窄和精度不高等，因此需要研制性能更好的微流控浓度梯度发生器，以满足更高的研究需要。构建氧气浓度梯度和化学浓度梯度的微流控芯片需要复杂的微流控芯片设计和精密的仪器。例如，L.Wang等人构建了氧气梯度和化学浓度提度双浓度梯度的微流控芯片(Lab Chip,2013,13,695–705.)，用于细胞研究，但是，这种微流控装置氧气梯度是通过直接向细胞培养基中加入耗氧试剂，化学试剂会改变细胞培养基的组成，更可能影响细胞行为。最近，Wen Chang等改进了氧气浓度的产生，采用对细胞无毒害的方式，制备了一种氧气梯度和化学浓度梯度双浓度梯度的PDMS-PC微流控芯片(Chia-Wen Chang,Yung-Ju Cheng,Melissa Tu,Ying-Hua Chen,Chien-Chung Peng,Wei-Hao Liaoa,Yi-Chung Tung,Lab Chip,2014,14,3762–3772)，但该芯片有三层复杂结构，操作繁琐。郑允焕等研究了一种用于药物筛选的微流控双层结构细胞阵列芯片，芯片设计了药物浓度梯度网络，通过对芯片3种共培养细胞活性的检测和药物伊立替康(CTP-11)对肝癌细胞的浓度梯度刺激等实验结果，验证该芯片在细胞研究和药物筛选等方面的可行性。

发明内容