[发明专利]次氯酸根离子荧光探针、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种次氯酸根离子荧光探针、制备方法及其应用。

背景技术

次氯酸根作为活性氧物种的一种，在免疫抵抗微生物感染和炎症过程中发挥着极其重要的作用。在生物体中，H₂O₂和氯离子在髓过氧化物酶的催化作用下产生次氯酸根，这是内因性次氯酸根的主要来源。保持适当的次氯酸根浓度对许多细胞功能至关重要，然而研究结果表明，一旦细胞内的次氯酸根水平不能保持在正常的生理水平范围内，将可能会导致多种疾病，例如动脉粥样硬化、关节炎、类风湿性关节炎甚至肿瘤。与其它类型探针相比，荧光探针拥有与生俱来的多项优势，它灵敏度高，特异性好，便于操作而且响应迅速，在生物医学领域不但可以用于体外分析还可以用于活体的影像学研究。最近几年来，能特异性检测HClO/ClOˉ的小分子荧光探针被大量报道。然而，其中许多探针水溶性差、灵敏度低、pH对其检测效果影响大，还有一些探针生物毒性大、细胞膜渗透能力差，这些缺陷很大程度上影响了探针的应用。因此，开发出能克服这些缺陷的新的荧光探针非常有必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种次氯酸根离子荧光探针，该荧光探针生物兼容性好、选择性高、灵敏度高，可方便检测次氯酸根离子，本发明还提供该荧光探针的制备方法以及该探针在次氯酸根检测中的应用

本发明的技术构思如下：该基于荧光素的衍生物探针可选择性与次氯酸根反应并产生强烈荧光，且在0-50μM次氯酸根离子浓度范围内所产生的荧光强度与离子浓度线性相关。本发明首次制备联氨吡啶基荧光素衍生物并首次将其用于次氯酸根离子的选择性检测，从而解决上述技术问题。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

本发明的次氯酸根离子荧光探针，其为如式Ⅰ所示的联氨吡啶基荧光素衍生物：

本发明上述次氯酸根离子荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：

第一步：将荧光素、氯仿、15-冠-5在甲醇溶液中反应，接着加入氢氧化钠溶液，反应后得到如式Ⅱ结构的荧光素单醛，

第二步：将荧光素单醛和肼基吡啶在乙醇溶液中反应生成的联氨吡啶基荧光素衍生物即为次氯酸根离子荧光探针。

本发明的上述次氯酸根离子荧光探针的制备方法，其进一步的技术方案是第一步的具体过程为：将荧光素溶于甲醇，加入摩尔比为2:1-10:1的氯仿,然后加入摩尔比为0.1％-10％15-冠-5，接着缓慢滴加10％-70％氢氧化钠溶液，反应结束后冷却，用浓度为10mol/L硫酸酸化，产生沉淀，过滤，收集沉淀，真空干燥，将产品用硅胶层析法分离，得到的浅黄色固体即为荧光素单醛。优选地，其反应条件为：于40-60℃温度下反应，持续搅拌回流5小时或以上；第一步中在层析柱纯化过程中采用体积比200:3的二氯甲烷:甲醇为洗脱液。

本发明的上述次氯酸根离子荧光探针的制备方法，其进一步的技术方案还可以是第二步的具体过程为：在30min内，向荧光素单醛的乙醇溶液中滴加溶有肼基吡啶的甲醇溶液进行反应，其中荧光素单醛和肼基吡啶的摩尔比为1：0.5-1:10。优选地，溶解肼基吡啶的甲醇应尽可能少量，可选择范围为不大于乙醇用量的1/8；其反应条件为：于室温下反应，持续搅拌12小时或以上。优选地，第二步反应后进行纯化：产品为沉淀，在反应溶剂中析出，收集产品烘干得粗品，然后用正戊烷洗涤即得次氯酸根离子荧光探针。

本发明上述次氯酸根离子荧光探针在次氯酸根离子含量检测、生物样本中次氯酸根的荧光显影中的应用。可用于环境中金离子含量的检测，生物样本中次氯酸根荧光显影及含量检测。

本发明的有益效果如下：

1)本发明荧光探针在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中呈粉红色且无荧光，与次氯酸根离子反应后显示黄色并且发出强烈的绿色荧光。

2)采用本发明荧光探针后，检测灵敏度高，对次氯酸根的检测限可达到10^-9M。

3)本发明荧光探针仅与次氯酸根发生荧光反应，对其它活性氧物种(ROS)包括H₂O₂、NO^·、^·O₂^-、ONOOˉ、ROO^·、¹O₂、^·OH均无反应，具有很好的选择性和特异性。此外，检测性能能耐受较大的pH变化范围并且具有适宜的荧光发射波长(521nm)。