[发明专利]抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白、由其制备的单克隆抗体及应用。

背景技术

斑点叉尾鮰病毒病(channel catfish virusdisese，CCVD)是斑点叉尾鮰鱼苗及幼鱼的主要传染性疾病，能够在短时间内造成40％～90％的鱼苗的死亡，危害严重，该病的病原1971年被确认为斑点叉尾鮰病毒(channel catfish virus，，CCV)。国内外检测这种病毒的方法主要有中和试验、点杂交检测技术、PCR技术、实时定量荧光探针PCR技术、免疫荧光技术等。这些方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、检测周期长等缺点，不能满足快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求，因此建立更灵敏快捷的检测技术对该病的防治具有重要的现实意义。近年建立在单克隆抗体基础上的间接免疫荧光(IF)和酶联免疫吸附试验(ELISA)已在鱼类病毒的检测中广泛报道，而目前关于斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的敏感性、特异性较强的单克隆抗体还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白。

本发明的第二个目的是利用上述重组蛋白制备一种抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体。

本发明的第三个目的是提供所述单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

编码所述重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的重组蛋白作为斑点叉尾鮰病毒囊膜抗原蛋白的应用。

一种单克隆抗体，它是由所述的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株3B8所分泌的，所述杂交瘤细胞株3B8保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC C2014242。

所述的单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。

本发明的优点在于：提供了抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46的单克隆抗体和产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明提供的单克隆抗体特异性强、生物结合活性高，与感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞(斑点叉尾鮰卵巢细胞)发生反应，而不与正常的CCO细胞反应，可应用于制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒，用于斑点叉尾鮰病毒的检测，检测时反应灵敏，从而为建立斑点叉尾鮰病毒的快速检测方法奠定了基础，为该病毒的早期诊断、临床快速检测、流行病学调查提供了有效的工具。

附图说明

图1是斑点叉尾鮰病毒免疫印迹法检测的荧光显微照片，图中1为CCO正常细胞，2为感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞。

图2是斑点叉尾鮰病毒间接免疫荧光检测的荧光显微照片，图中A为感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞，B为CCO正常细胞。

具体实施方式

实施例1抗原的制备

1.斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因片段的PCR扩增

根据斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因序列(GenBank登录号：AAA88149.1)，并分析蛋白OFR46的免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果显示在233-590位氨基酸片段的亲水性及抗原指数较高且位于膜外区，故选取233-590位氨基酸的基因序列设计引物，以斑点叉尾鮰病毒的DNA为模板，PCR扩增该序列。其中，扩增的引物序列分别在上、下游引物中加入BamHI、HindⅢ，上游引物加入起始密码子，下游引物加入终止密码子。

上游引物为：5'-AAAGGATCCATGTGTTACGGTCCGTTGGCC-3'，

下游引物为：5'-AAAAAGCTTTCAAGAGAAATCGACGGCGT-3'，

划线部分为酶切位点。

2.斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因片段原核表达质粒的构建

斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF46基因片段和pGEX-KG载体分别用BamHI、HindⅢ双酶切后，使用胶回收试剂盒回收酶切目的片段和载体，然后在T4DNA连接酶的作用下16℃进行连接，所得到的阳性重组质粒CCV-ORF46-KG送到北京擎科新业生物技术有限公司进行测序确认。

3.重组质粒CCV-ORF46-KG的诱导表达