[发明专利]一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂

说明书

本发明公开了一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂，该方法包括如下步骤：使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，形成两端连接第一接头并形成缺口的片段；在缺口处连接第二接头；进行第一PCR反应，得到两端分别连接第一接头和第二接头序列的产物；酶切产生切口，然后进行双链环化产生环状核酸分子；从切口处进行限制性缺口平移反应；消化未发生限制性缺口平移反应的部分；连接第三接头和寡核苷酸接头序列；进行第二PCR反应，得到两端分别连接第三接头和寡核苷酸接头序列的产物；分离出核酸单链；对核酸单链进行环化，得到单链环状文库。本发明的方法通过转座酶打断与限制性缺口平移反应结合，实现简单、快速的核酸单链环状文库的构建。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂。

背景技术

自从罗氏发明了焦磷酸测序方法开辟了二代测序以来，直至现在，二代测序经历了一段高速发展时期。但随着高通量测序的发展，高通量和低成本的样本制备环节逐渐成了测序领域的一个重点考虑的因素。各种原理的样本处理方法及自动化装置不断被研发出来，主要包括样本片段化、核酸分子的末端处理及接头连接并最终的出库。

其中片段化主要分为物理方法(如超声剪切)或酶学方法(即非特异的核酸内切酶处理)来实现的。其中，物理方法以基于专利的自适应聚焦超声(Adaptive FocusedAcoustic，AFA)技术的Covaris打断仪为主。在等温条件下，利用几何聚焦声波能量，通过＞400kHz的球面固态超声传感器将波长为1mm的声波能量聚焦在样品上。该方法确保了核酸样品的完整性得以保留，并能实现高的回收率。Covaris打断仪包括经济的M系列、单管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。基于物理方法打断的片段随机性良好，但是通量上也要依赖大量的Covaris打断仪，同时需要后续单独进行末端处理、加接头和PCR以及各种纯化操作。酶学方法有一种NEB公司推出的NEB Next dsDNA Fragmentase。该试剂首先在双链DNA产生随机的切刻，然后通过另一种酶识别切刻位点来切割互补的DNA链，从而实现打断的目的。这种试剂可以用于基因组DNA、全基因组扩增产物和PCR产物等，随机性也较好，但是会产生一些人工的短片段插入和缺失，同时也不可避免的需要后续单独进行末端处理、加接头和PCR以及相应的纯化操作。另外，以Epicentra公司(已被IllμMina收购)Nextera试剂盒领衔的转座酶打断试剂盒，利用转座酶同时完成DNA片段化和接头的添加，从而减少样品处理的时间。

从各种操作的简便性来看，转座酶打断的方式无疑在通量及操作简便性上远远胜过其他方法，但是这种打断方式也有自身的缺点：转座酶实现转座依赖特定的19bp Me序列。因此，虽然转座酶可以通过包埋两种完全不同的接头序列在靶序列的5’端和3’端加上不同的接头序列，但是接头均需要含有Me特定序列，产生的后果即打断所产生的片段的两端会对称的各有一个Me序列，并且由于转座酶的特殊作用使得目的序列和Me序列间存在一个9nt的缺口。靶序列邻近的两端完全一致的Me序列会对下游的一些技术应用带来影响，比如基于连接法的二代测序技术，同一条链两侧的Me序列为互补的序列，从而容易引起单链分子内部出现退火而不利于锚定引物的结合。

迄今为止，未有专利及其它文献报道一种能够极其高效快速地采用转座酶技术打断靶序列并将打断后的序列修正为两段完全不同序列的分子生物学实验方法。

发明内容

本发明提供一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂，通过转座酶打断与限制性缺口平移反应结合，实现简单、快速的核酸单链环状文库的构建。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种核酸单链环状文库的构建方法，包括如下步骤：

使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头，打断的核酸两端连接第一接头并且形成缺口；

去除体系中的转座酶，然后使用连接酶在缺口处连接上第二接头，第二接头的序列不同于第一接头；