[发明专利]电穿孔用电脉冲发生器和具备所述电脉冲发生器的电穿孔装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有穿孔脉冲发生机构和传输脉冲发生机构的多级式电穿孔用电脉冲发生器，其可对应对象物的阻抗的不同，将穿孔脉冲的电压在几十至几千伏特的极广范围内进行切换调整，且可稳定产生多次的穿孔脉冲。

此外，本发明涉及一种具备前述脉冲发生器的电穿孔装置、以及使用了前述装置的基因转移法。

背景技术

电穿孔装置，是用于实现通过电刺激而使对象细胞的细胞膜开启微细孔，并将DNA等核酸分子或药剂成分等，简便且有效率地转移入细胞内(电穿孔法(Electroporation))的装置。

特别地，在生命科学领域的研究开发现场，是将其视为用以使外源DNA或RNA等转移入细胞内的装置中极其重要的装置，且其是在许多领域中需求渐渐扩大的装置。此外，基于装置操作的容易处理性的观点、能够以较低的费用导入设备的装置的观点等，其是具有极高利用价值的装置，这也成为电穿孔的需求扩大的重要因素。

然而，伴随着电穿孔在产业技术领域中需求的增大，各领域开始期望可适用于各种现场的电穿孔装置的登场。即，伴随着电穿孔法的使用对象多用化，由于不同生物种或组织等导致适合转移对象的溶液(特别是溶液的电阻)的不同、细胞学性质(细胞大小、细胞膜特性等)大相径庭，因此期望出现一种可应对个别的转移对象施予合适化条件的电脉冲的装置。

特别是对象物的电阻(阻抗)的不同，会给予电穿孔的电条件很大影响。例如，对于哺乳类细胞等进行电脉冲处理时，由于通常的电穿孔缓冲溶液或培养溶液含有盐或缓冲成分，故施予电脉冲的对象物的阻抗会变得较低。因此，对于哺乳类细胞等进行电穿孔时，必须施予较为“低电压”的电脉冲(具有可使细胞开启微细孔的能量且是较为低电压的约几十至几百伏特的电脉冲)。

另一方面，对于细菌或酵母菌等进行电脉冲处理时，为了抑制细胞的损伤、保持感受态(形质转换效率)，必须在添加有甘油、醣类等的高阻抗的溶液(电阻高的溶液)中进行电穿孔处理。因此，对于细菌等进行电穿孔，必须施予“高电压”的电脉冲(约几百至几千伏特的高电压脉冲)。

为了对于高阻抗对象产生“几千伏特的电脉冲”以实现电穿孔，必须具有电源和专用电路，从而将输入电压升压并使其积蓄于电容器而产生高电压脉冲。

通常，为了使电荷积蓄于电容器而产生高电压电脉冲，对应于所需电压带的专用直流电源和充电用电路(电容器电路的充电所必需的电路：切换电路、升压电路、整流电路等的一系列电路结构)是必要的。

在此，在为产生高电压而将电容器串联的电路中，因电容量变小，对于输出脉冲的电压峰值的衰减变大的低阻抗对象物进行电穿孔时，会有无法确保充分的电容量的问题发生。即，若仅采用单纯的高电压发生电路，则在对于电阻低的对象物施予电压脉冲时，存在无法稳定且充分地产生多次脉冲的问题发生。

因此，若希望在同一装置内实现低电压脉冲的发生与高电压脉冲的发生，则在具有“充分确保电容量的几十至几百伏特的低电压脉冲用直流电源和充电电路”的同时，必须另外具有“几百至几千伏特的高电压用直流电源和充电用电路”，故会有制造成本大幅增加的问题发生。

此外，作为高耐电压电容器，虽考虑到成本层面而一般使用化学电容器，但市售的化学电容器充其量只达到耐电压450V、电容量560μF的程度，故在目前的情况下，难以低成本采购耐电压超过500V者。

特别地，所谓应对此高低的电压带而必需具有各种电源电路所带来的问题，在“多级式电穿孔装置”的制造中成为一大问题。

在此，多级式电穿孔装置，是指为了实现多级的电脉冲的发生从而使针对转移对象的转移效率和生存率这两方面均得到飞跃性地提升的装置。

具体而言，是指使连续施予高电压且短时间的电脉冲(下面称为穿孔脉冲或Pp)、以及低电压且脉冲宽度长的电脉冲(下面称为传输脉冲或Tp)的电穿孔法成为可能的装置。

如此多级方式的电穿孔装置，已由多个制造商在进行装置的制造销售。可列举例如内帕基因(NepaGene)株式会社制造的NEPA21电穿孔装置。此外，关于电穿孔电源的专利文献，可列举出专利文献1。(另外，专利文献1中，穿孔脉冲(poring pulse)是以穿孔脉冲(poration pulse)来表示，传输脉冲(transfer pulse)是以驱动脉冲(driving pluse)来表示。)

然而，多级方式的电穿孔装置，是已集成安装有“穿孔脉冲用电源电路”和“传输脉冲用电源电路”的至少两种电源电路的装置方式。