[发明专利]永生化的猪肺泡巨噬细胞

说明书

本发明涉及永生化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，包含此类PAM的细胞培养物，用于永生化PAM的方法，在永生化的PAM上复制PRRS病毒的方法，和用于制备包含PRRSV的疫苗的方法。

猪呼吸和繁殖综合征病毒(PRRSV)是目前为止经济上最重要的动脉炎病毒，影响全世界的猪养殖产业。该病毒的感染导致断奶至肥育猪的缓慢生长、降低的饲料效率、厌食和发热，妊娠母猪的流产和仔猪的呼吸困难。仅在美国，每年与PRRSV感染相关的损失在2005年估计为5.6亿美元左右，在2011年估计为6.64亿美元左右。PRRSV感染列为养猪业健康的第一挑战。考虑到2006年在东南亚出现PRRSV的高强毒株和亚洲养猪业是世界上最大的事实，可以安全地假定，在世界的这部分的损失甚至相当高于对于欧洲和美国报道的损失。

PRRSV仍然是对养猪业的主要威胁，因为相关疾病已被证明难以控制，尽管可用针对PRRSV的活减毒和灭活疫苗。

对于PRRSV疫苗生产，活减毒或灭活的病毒必须在易感细胞上复制。PRRSV的繁殖中面对的问题之一是病毒的高度受限细胞嗜性。它主要感染原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)。此类PAM难以获得：它们通常通过通常6-12周龄的仔猪的肺灌洗获得(Wensvoort,G.等人,TheVeterinaryQuarterly13:121-130(1991))。该方法是麻烦的，昂贵的，并导致具有高度批次间不一致性的批次。此外，原代PAM只能在细胞培养中保持非常有限的时间。因此，尽管原代PAM非常适合于使PRRSV生长，但它们只用于例如实验感染研究中和用于制备实验疫苗。在原代PAM上生产商业疫苗在经济上是不可行的。

由于该问题，科学家们已经试图寻找易感PRRSV的其他细胞或更好的细胞系。仅已经鉴定了三种细胞系：MA104猴肾细胞系和MA104的两种衍生物：MARC-145和CL2621细胞(KumarShanmukhappa等人,VirologyJournal2007,4:62)。这些细胞系目前商业上用于繁殖PRRSV。

尽管可能使PRRSV在这些细胞系上生长至相对高滴度，但此类甚至不是猪细胞系的非PAM具有缺点：由于它们不是PRRSV的天然宿主，所以PRRSV必须在可以获得高滴度之前适应这些细胞系。作为结果，MA104或MARC-145或CL2621都不是用于繁殖新发现的野生毒株的第一选择。为了挑取新的PRRSV野生型分离株，天然宿主细胞PAM会合适得多。

已经考虑，永生化的PAM细胞系可以为上述问题提供解决方案。

永生化的PAM细胞系在原则上可以不限于它们的传代水平地生长，并且它们是用于PRRSV的最合适的宿主细胞。

已经进行了几种尝试以开发永生化的PAM细胞系。

PCT专利申请WO2008/089094公开了从猪胚胎获得的两种自然的故意未转化的PAM突变体。这些细胞显示永生化的PAM细胞系行为，并且它们能够使PRRSV生长。所述方法的缺点是，它是结果高度不确定的基于试验和误差的方法。具体地，使用该方法分离的任何胎细胞系是否的确以稳定的方式永生化或仅具有稍微延长的寿命或能够相比于原代PAM仅多分裂几次是有问题的。该方法因此对于需要永生化的PAM细胞系的本领域技术人员是有吸引力的。

Jian-JunJia的论文(2009年8月,UniversitedeMontreal,Montreal,Canada)描述了据称易感PRRSV的猪肺细胞，但该细胞系不是肺泡细胞系，而是上皮细胞系，并后来进一步发现不是猪来源的(D.W.Silversides等人,Journalofvirology84:5454-5455(2010))。

H.M.Weingartl等人于J.Virol.Meth.104:203-216(2002)中描述了制备真正的永生化PAM细胞系的进一步尝试。Weingartl描述了用携带新霉素抗性和SV40T抗原的基因的质粒pSV3neo转染原代PAM。这导致三种髓系(单核细胞/巨噬细胞)永生化的细胞系的分离。但是，该实验的结果竟然是谜一样的：在任何这些细胞系中都没有检测到SV40T抗原，此外，所述细胞系无一支持PRRSV复制。因此，Weingartl得出结论，另一种机制，不是SV40T抗原的存在，可能是永生化的原因。

该失败后，使用SV40T抗原的途径被留作替代方法。