[发明专利]肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM)用于C端酰胺化的用途

说明书

本发明是重组多肽生产领域。本文公开体内使用肽基甘氨肽α酰胺化 单氧加氧酶(PAM)获得C端酰胺化多肽的方法。

背景技术

近年来多肽生产稳步增加，蛋白质有可能在不久的将来成为可用于各 种疾病治疗的最大一组治疗剂。蛋白质的影响来自其特异性，例如特异的 靶识别和结合功能。

细胞培养物用于发酵工艺中生产物质，尤其是蛋白质。可以区分以下 两种不同的工艺，其一工艺中细胞培养物是未遗传修饰的并生成其自身的 代谢产物，而在另一工艺中生物体被遗传修饰以产生更大量的其自身物质 例如蛋白质、或产生其在未有所述修饰时不产生的物质例如外源(异源)物 质。

一半以上的生物反应性神经肽和肽激素在其C端是酰胺化的。该合成 通常发生在内分泌细胞、神经元细胞或其它特殊分化的分泌细胞中。酰胺 化肽的生物合成前体是C端甘氨酸延伸的中间体。甘氨酸延伸中间体通常 从更大的前体通过在加工位点(一般由一个或多个碱性氨基酸组成)的最初 内切蛋白水解切割而产生。之后，C端碱性残基被特定的羧肽酶除去(综述 参见例如Bradbury,A.F.和Smyth,D.G.,TIBS16(1991)112-115)。

(α-)酰胺化活性包括两个不同的酶促活性——由肽基甘氨肽α-酰胺 化单氧加氧酶(PAM)介导的羟化酶步骤和裂合酶步骤。

Wulf,B.S.,等(Mol.Cell.Endocrin.91(1993)135-141)报道，非 内分泌细胞对C-肽缺失的NPY前体的有效酰胺化受到C端Lys-Arg存在 的影响。Tateishi,K.等(Biochem.Biophys.Res.Com.205(1994) 282-290)报道了人胰腺肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶的分离和功能性表 达。Takahashi,K.-Y.等(Peptides18(1996)439-444)报道了生物活性鲑鱼 降钙素自COS-7和CHO细胞的生产。Liu,Z.,等(Mol.Biotechnol.24 (2003)21-26)报道了蝎毒素BmkITa1cDNA在昆虫细胞中的克隆、与酰胺 化酶的共表达、和活性。ManabuSatani等(ProteinExpressPurif.28 (2003)293-302)描述了人双功能肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶的表达和 表征。NozerM.Metha等(Post-translationalmodificationofprotein pharmaceuticals(2009)253-276)报道了C端α-酰胺化。

发明概述

已经发现，使用一定比例的(待酰胺化的)多肽编码核酸与PAM编码核 酸，可以有利地实现生产的多肽的C端酰胺化与产量的有益比例。

此外，还发现，使用膜结合形式的PAM(PAM2)或缺失跨膜域的可溶 形式PAM(PAM3)，就酰胺化和产量而言，没有不同。

本文公开的一个方面是，用于对多肽进行体内C端酰胺化的方法，其 特征在于，(待酰胺化)多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)两 者在哺乳动物细胞中重组共表达(以重组方式共表达)。

本文公开的一个方面是，重组生产C端酰胺化多肽的方法，其特征在 于，多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)两者在哺乳动物细胞 中重组共表达(以重组方式共表达)。

在所有方面的一个优选实施方案中，人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧 酶(PAM)是PAM3(SEQIDNO:02)。

在所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞用第一载体和第二载体 共转染，第一载体包含含有编码(待酰胺化)多肽的核酸的表达盒，第二载 体包含含有编码PAM的核酸的表达盒。

在所有方面的一个实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约 90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一载体与第二载体 的比例为大约70:30至大约60:40。在所有方面的一个优选实施方案中， 第一载体与第二载体的比例为大约70:30至大约60:40，且人肽基甘氨肽 α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQIDNO:02)。

在所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞包含编码多肽的第一核 酸和编码PAM的第二核酸。