[发明专利]用于DNA末端修复、腺苷酸化、磷酸化的酶组合物

说明书

本申请要求2013年9月25日提交的美国专利申请序列号61/882,480和2013年11月 15日提交的美国专利申请序列号61/904,543的优先权，每个专利申请通过引用整体并入本 文。

用于高通量DNA测序的几种方法(Nature.437,376-380(2005)；Science.309 (2005)728-1732)依赖通用的扩增反应，借此使DNA样本随机成片段，然后被处理，使得不同 片段的末端均含有相同的DNA序列。可将具有通用末端的片段用单一对扩增引物在单一反 应中进行扩增。在扩增前将片段文库分离成单分子水平确保被扩增的分子形成离散的群 体。然后可进一步分析这些离散的群体。或者可在乳剂中(Nature.437,376-380(2005)； Science.309,5741,1728-1732(2005))或在表面上(NucleicAcidsResearch27,e34 (1999)；NucleicAcidsResearch28,e87(2000))进行该分离。

将通用启动序列添加到可待由聚合酶链式反应(PCR)扩增的靶的末端，可通过本 领域那些技术人员所已知的多种方法来实现。例如，在其5'端含有通用序列，并在其3'端含 有简并序列的通用引物可用于PCR(DOP-PCR,例如,PNAS93(1996)14676-14679)以扩增随 机来自复杂靶序列或靶序列的复杂混合物的片段。该引物的简并3'部分在随机DNA位置退 火，且可被延伸以生成在其5'端具有该通用序列的靶的拷贝。

或者，可将含有通用启动序列的接头连接到所述靶序列的末端。该接头可以是单 链的或双链的。双链接头可能具有突出端或可能具有平端。具有突出端的接头与靶序列上 的突出端互补，该靶序列可能已经由限制性内切核酸酶消化而生成，或由DNA聚合酶或末端 转移酶添加。具有平端的接头用在也是平端的靶，在将所述DNA剪切成片段的过程中形成， 或由如本领域技术人员所已知的末端修复反应所形成。

单一接头或两个不同接头可能与靶序列用于连接反应中。如果靶已被操作使得它 的末端是一样的，即，两末端均是平的或两端均具有相同的突出，则单一相容的接头的连接 将生成两端均具有那个接头的模板。然而，如果使用两个相容的接头，接头A和接头B，则形 成连接产物的三种排列：在两端具有接头A的模板、在两端具有接头B的模板以及一端具有 接头A且另一端具有接头B的模板。此最后的产物是，在一些情况下，来自连接反应唯一所需 的产物，并且因此连接反应后的另外的纯化步骤是必要的，以从两端具有相同接头的连接 产物中将其纯化。

许多分子生物学研究技术和应用，如为下一代测序(NGS)制备DNA文库需要将合成 的DNA接头添加到受关注的DNA片段的两端。通常通过以下步骤添加合成的接头：(1)通过物 理方式或酶促剪切受关注的DNA样本，(2)将所得的DNA片段进行钝化和磷酸化；(3)将钝化 的DNA片段的3'端由一个核苷酸延伸，优选由dATP延伸，(4)将所得的DNA片段连接到3'端具 有dTTP延伸的接头。靶DNA片段的dA加尾防止它们与其它DNA片段的分子内或分子间的连 接，且从而增加具有预期结构的片段的产率。

最近意识到DNA片段的末端修复/钝化和dA加尾反应可在一个管内完成，首先通过 在较低的温度下进行DNA钝化和磷酸化反应，然后在较高的温度下对该钝化的DNA片段进行 加尾。可获得以类似的方式工作的商业NGS样本制备试剂盒(NxSeqDNASamplePrepKit, Lucigen；NEBNextUltraDNALibraryPrepKit,IlluminafromNEB；PureGenomeHENGS LibraryPrepReagents,EMDMilipore)。然而，只有EMDMillipore公开了用于DNA3'端 末端延伸的酶：嗜热NovaTaqDNA聚合酶。其它两个供应商提供产品使用推荐(在65-72℃下 孵育)，其引起本领域的技术人员认为嗜热DNA聚合酶还用于dA加尾步骤。表1显示来自 NewEnglandBiolabs、EMDMilipore和Lucigen的DNA末端修复和dA加尾反应的商业试剂和 方案。

表1.来自商业供应商试剂盒所使用的单管DNA末端修复和dA加尾条件和试剂。