[发明专利]外源性基因表达增强剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种在利用了家蚕绢丝腺的蛋白质表达系统中将反义 RNA表达载体作为有效成分的外源性基因表达增强剂，和具有该反义 RNA表达载体的基因重组家蚕。

背景技术

家蚕(Bombyxmori)的绢丝腺，具有短时间合成大量蛋白质的能 力。另外，由于家蚕的绢丝腺是大型器官所以容易摘出，合成的蛋白质 被保存于绢丝腺内腔，所以也具有容易回收的优点。因此，利用绢丝腺 表达目标蛋白质的基因重组家蚕，被视为有希望作为有用蛋白质或高性 能丝等附加值高的蛋白质的大量生产系统。

家蚕绢丝腺，形态学上是如图1所示的左右1对的器官，分别由前 部绢丝腺、中部绢丝腺和后部绢丝腺3个区域构成。在中部绢丝腺细胞 内，合成作为绢丝的覆盖成分的水溶性的明胶样蛋白质、丝胶蛋白1(本 说明书中，常常简称为“Ser1”)、丝胶蛋白2(本说明书中，常常简称 为“Ser2”)和丝胶蛋白3(本说明书中，常常简称为“Ser3”)(图1)。 这些蛋白质，在合成后被分泌至中部绢丝腺内腔中。另外，在后部绢丝 腺细胞内，合成构成属于绢丝纤维成分的丝素蛋白的3个主要蛋白质即 丝素蛋白H链(本说明书中，常常简称为“FibH”)、丝素蛋白L链(本 说明书中，常常简称为“FibL”)和p25/FHX(以下，记为“p25”)。这 3个蛋白质以FibH：FibL：p25＝6:6:1的比率形成复合物(silkfibroin elementaryunit；本说明书中，以下称为“SFEU复合物”)，分泌至后 部绢丝腺内腔中。然后，SFEU复合物转移至中部绢丝腺内腔，被丝胶 蛋白覆盖，作为绢丝从前部绢丝腺吐丝(图1：非专利文献1)。因此， 将家蚕绢丝腺作为蛋白质表达系统利用时，利用中部绢丝腺或后部绢丝 腺中特异性表达的基因表达系统即可。实际上，目前为止作为使用中部 绢丝腺的重组蛋白质表达系统，确立了利用GAL4/UAS系统(非专利 文献2)或将Ser1启动子和Hr3增强子进行组合的系统的大量表达方 法(非专利文献3)。

在利用家蚕绢丝腺的蛋白质表达系统中，为了提高目标蛋白质的生 产效率，提高该基因的表达量本身、通过减少绢丝腺的其他主要蛋白质 量从而使目标蛋白质的表达量相对上升以及从家蚕有效回收目标蛋白 质是重要的。阻碍蛋白质回收的原因之一，可举出夹杂蛋白质的存在。 例如，可举出作为绢丝腺的主要蛋白质的丝素蛋白、丝胶蛋白。这些蛋 白质由于合成量多，且是纤维品质，粘稠性、结晶性高，因此容易成为 目标蛋白质提取或精制时堵塞柱或过滤器的原因。因此，对于蛋白质的 有效回收，需要抑制这些夹杂蛋白质的基因表达。另一方面，家蚕绢丝 腺中表达的这些基因的过度的表达抑制，由于会对家蚕的生长本身产生 影响，因此需要控制该表达抑制的技术。

家蚕绢丝腺中，抑制内源性丝素蛋白或丝胶蛋白的表达的方法中， 包括使用已有的基因突变系统的方法和人为抑制这些基因的表达的方 法。

作为使用已有的基因突变系统的方法的例子，已知在家蚕中由后部 绢丝腺表达的FibH链具有异常的Nd系统、FibL链具有异常的Nd-s 系统和Nd-sD系统。由于Nd系统中FibH链的表达或者Nd-s系统和 Nd-sD系统中FibL链的表达非常低，因此通过使用这些系统利用中部 绢丝腺使目标蛋白质表达能够提高其表达量(专利文献1)。但是，上述 基因突变系统，不能抑制由中部绢丝腺表达的Ser1等基因表达，另外， 由家蚕的中部绢丝腺表达的基因的突变系统等目前为止没有报告。

作为人为抑制基因的表达的方法的例子，可举出RNAi(RNA inteference)法。RNAi法是在生物体内介由靶基因的转录产物的分解， 抑制(沉默)该基因的表达的方法。通常在RNAi法中，使用由双链 RNA构成的siRNA(smallinterferingRNA)或miRNA(microRNA) 以及由单链RNA构成通过自折叠(self-folding)在分子内形成双链RNA 区域的shRNA(shorthairpinRNA)等RNAi分子。另一方面，由单 链RNA构成且不形成分子内双链RNA区域的反义RNA(本说明书中， 常常记为“asRNA”)与靶mRNA退火，最终经过与双链RNA相同过 程发挥RNAi所致的基因的表达抑制效果。但是，由于与其他RNAi分 子相比其效果非常低，因此基本没有使用(非专利文献4)。