[发明专利]用于转基因表达的载体

说明书

本发明涉及一种载体系统，其涉及用不相关的短间隔子序列替换土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列，供于感兴趣的核苷酸在逆转录病毒载体系统中的高效表达，以及用于递送并表达感兴趣的核苷酸至靶细胞的方法。

通过引用纳入

本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及对于本文所述的或通过引用纳入任何文件中的任何产品的任何生产商的指南、说明、产品说明书和产品页，均通过引用纳入本文，并且可用于本发明实践中。更具体地，所有参考文献都以相同程度通过引用纳人本文，就如各文献被具体地和单独地说明通过引用纳入本文一样。

发明领域

本发明涉及一种载体系统，其可包含替换转录后调控元件的间隔子(spacer)或填充(stuffer)核苷酸序列(SNS)。具体而言，本发明涉及用不相关的短间隔子序列替换土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列，所述短间隔子序列促进感兴趣的核苷酸在逆转录病毒载体系统中的高效表达。本发明还涉及递送和表达感兴趣的核苷酸至靶细胞的方法。

发明背景

逆转录病毒载体系统，例如慢病毒载体系统，已被建议用作递送系统。WO98/17815涉及移除多个附属基因(accessory gene)。WO99/45126涉及gag-pol序列的密码子优化，作为寻求克服Rev/RRE的输出要求并增强RNA稳定性的手段。

乙型肝炎病毒(HBV)转录后调控元件(PRE)和内含子可能是功能性等同物[Huang,Z.M.和Yen,T.S.(1995)Mol.Cell.Biol.15:3864-386])。土拨鼠肝炎病毒(WHV)，一种与HBV紧密相关的病毒，也具有PRE(本文称作WPRE；参见US 6,136,597和US 6,287,814)。在慢病毒载体中插入WPRE导致显著增强的报告基因的表达，例如，许多不同物种的多种细胞中的荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)[Zufferey，R.等，(1999)J.Virol 73:2886-2892]。刺激与转导的细胞的周期状态无关。

WPRE包含对于其增强表达水平的功能而言重要的三种顺式作用的序列。然而，此外，其包含约180个碱基对(bp)的片段，其可包含WHV X蛋白开放阅读框的5’末端，及其相关的启动子。已将全长X蛋白与肿瘤发生相关[Flajolet,M.等，(1998)J.Virol.72:6175-6180]。这已通过如下方式被直接证明[US7,419,829]：通过将EIAV载体给予胎内的胎儿小鼠：用包含野生型EIAV的载体转导的小鼠发展肝肿瘤，而用缺失WPRE的载体转导的小鼠没有发展肝肿瘤。已知，因病毒DNA插入宿主基因组所致的myc家族癌基因的顺式活化的肿瘤发生活性是WHV介导的癌发生的关键机制(Buendia，M.A.(1994)刊于C.Brechot(编)，《原发性肝癌：病因学和进展因子》(Primary liver cancer:etiological and progressionfactors)，第211-224页；CRC出版社，佛罗里达州波卡拉顿；Fourel,G.(1994)刊于F.Tronche和M.Yaniv(编)，《肝基因表达》(Liver gene expression)，第297-343页；R.G.兰德斯公司(R.G.Landes Company)，德克萨斯州奥斯汀)。此外，在人肝细胞癌中，在C末端截短的乙型肝炎病毒X蛋白可能比全长X蛋白更具致瘤性(Tu H等.2001肝细胞癌组织中乙型肝炎病毒X蛋白的天然COOH末端缺失的生物学影响(Biological impact of naturalCOOH-terminal delections of hepatitis B virus X protein in hepatocellularcarcinoma tissues).Cancer Res 61:7803-7810)。