[发明专利]变体酶

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求所有在2013年7月29日提交的美国临时专利申请序列号61/859,630、 61/859,666、61/859,680、61/859,704、61/859,712、61/859,721和61/859,735的优先权权 益，所有这些专利内容全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开总体上涉及糖基水解酶变体，尤其是糖基水解酶家族61的某些氧化还原酶 的变体。本发明还描述了编码糖基水解酶变体的核酸、包含糖基水解酶变体的组合物、制备 变体的方法以及使用变体的方法。

政府权利

本发明是在政府支持下遵照能源部颁发的有条件奖励项目No:De-Fc36- 08go18078做出的。政府在本发明中享有一定权利。

发明背景

纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多产生 胞外酶的微生物(包括细菌、酵母和真菌)降解并且用作能量源，所述胞外酶能够将聚合底 物水解成单体糖(Aro等人，2001)。因为非可再生资源方法的局限性，纤维素成为主要可再 生能源的潜能是巨大的(Krishna等人，2001)。通过生物方法对纤维素的有效利用是克服食 品、饲料和燃料短缺的一种途径(Ohmiya等人，1997)。

纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、 纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类别：内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4) (“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(β-D-葡糖 苷葡糖水解酶；EC3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，1987；Shulein，1988)。内切葡聚糖酶主 要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen 和Penttila，1995)。β-葡糖苷酶用于从纤维二糖、纤维低聚糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄 糖单元(Freer,1993)。

已知很多细菌、酵母和真菌产生纤维素酶。某些真菌产生能够降解纤维素的结晶 形式的全纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。丝状真菌发挥特别的作用， 因为许多酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)缺乏水解纤维素的能力。(参见， 例如，Aro等人，2001；Aubert等人，1988；Wood等人，1988和Coughlan等人。)

CBH、EG和BG的真菌纤维素酶类别可进一步扩展以在每个类别内包括多个组分。例 如，已经从包括里氏木霉(Trichodermareesei)的多种真菌来源分离得到多种CBH、EG和 BG，里氏木霉(Trichodermareesei)含有产生2种CBH(例如，CBHI(也称为Cel7A或糖基水 解酶家族(GH)7A)和CBHII(也称为Cel6A或GH6A))的已知基因、多种EG(例如，EGI(也称为 Cel7B或GH7B)、EGII(也称为Cel5A或GH5A)、EGIII(也称为Cel12A或GH12A)、EGV(也称为 Cel45A或GH45A)、EGVI(也称为Cel74A或GH74A)、EGVII(也称为Cel61B或GH61b)和EGVIII) 的已知基因、以及一系列BG(例如BG1、BG3和BG5)的已知基因。

为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，通常需要包含来自CBH、EG和BG每个类别 的组分或酶活性的全纤维素酶体系，其中分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效 (Filho等人，1996)。已观察到来自不同类别的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG 型纤维素酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以更有效地降解纤维素。(参见，例如，Wood， 1985)。

纤维素酶用于处理纺织物以增强洗涤剂组合物的清洁能力、用作软化剂、用于改 善棉织物的触感和外观等(Kumar等人，1997)是本领域已知的。