[发明专利]新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和由该方法得到的抗体

说明书

技术领域

本发明(第一方式)是将具有用于特异性纯化靶分子(例如，抗体或源自抗 体的物质。以下有时将它们总称为抗体等)的亲和配体的载体和具有阳离子 交换基团的载体作为整体来使用而对抗体等进行纯化的方法，本发明涉及在 一个色谱步骤中实施亲和色谱纯化和阳离子交换色谱纯化的新抗体纯化方 法及由该方法得到的抗体。

另外，本发明(第二方式)是使用了阳离子交换基团(以下也称为具有阳离 子交换基团的载体、阳离子交换载体)的抗体等(抗体或源自抗体的物质)的新 纯化法，本发明涉及pH4.0以下的抗体等的纯化方法及由该方法得到的抗 体，但作为以羧基为配体的阳离子交换载体的使用pH，通常不会选择pH4.0 以下。

背景技术

作为以抗体为主药的抗体医药品的主要成分的单克隆抗体，主要使用哺 乳类培养细胞等以重组蛋白质的形式在培养液中表达，通过多步色谱、膜工 序纯化至高纯度，然后进行制剂。抗体医药品为免疫球蛋白G及其类似物， 一般而言除了称为抗体的分子以外，还含有由作为免疫球蛋白分子的恒定区 的Fc区与其它功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质(含有Fc的分 子)。而且还包含Fab、scFv、以及双抗体(diabody)等低分子化抗体。另外， 这些抗体医药品还包含以微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药 品、在菌体内或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药 品。

该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体(二聚体以上的 多聚体)成为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的 重要课题。在此，所谓单体，例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定 义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体具有下述构成：由作为恒定区的 Fc区和可变区构成的重链(H链)2分子以及由可变区域构成的轻链(L链)2分 子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的副作用的主要 原因。

在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝 试了对抑制凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除了抑 制凝聚体的生成以外，将其除去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发 一种简便且有效的凝聚体除去技术。

抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的 模板化(平台化)不断发展，在其初期纯化工序(回收工序)中，广泛利用将作 为配体的蛋白质A固定化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质(蛋白质 A载体)。一般而言，使用在中性条件下使抗体吸附于蛋白质A载体，并在 酸性条件下洗脱抗体的方法，但通常通过3步色谱纯化而使其高纯度化，在 蛋白质A色谱工序的后段，可以通过离子交换色谱、疏水性相互作用色谱 等的组合来除去凝聚体等杂质(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、 专利文献5)。

亲和配体具有与特定分子特异性结合的功能，将该配体固定化于水不溶 性载体而形成的亲和分离基质(也称为亲和色谱载体、亲和载体)用于从含有 生物体成分、重组体的微生物和哺乳类培养细胞中有效地分离纯化有用物 质。作为实际工业上利用的抗体亲和配体，例如可以举出：由蛋白质A、蛋 白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能性修饰体(类似 物)构成的肽性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体(ラクダー一本鎖)或抗体的Fc 受体等重组蛋白质性配体、及噻唑衍生物等化学合成性配体，可以用于抗体 医药品等的纯化。抗体医药品相对于化学药品显示更低的毒性且显示更高的 特异性，因此，作为理想的医药品，其需求不断增高。

对于利用亲和载体的分离纯化而言，其课题在于抗体的凝聚体、源自宿 主的杂质、抗体的分解物等(以下称为凝聚体等)的除去。

例如，作为亲和载体的一个例子，在蛋白质A色谱工序中，通常进行酸 性洗脱，但是由于各种抗体的洗脱pH不同需要时间进行工艺设计，另外洗 脱pH越低，形成凝聚体的风险越高，因此，对蛋白质A配体进行了施加蛋 白质工程学修饰的尝试，使得需要pH3左右的较低pH洗脱的抗体也能够在 pH3.5～4左右洗脱(专利文献1)。

另外，蛋白质A色谱工序后凝聚体含量较多的情况下，在后段的杂质除 去工序中会导致目标单体(monomer)的收率降低，因此，除了尝试抑制蛋白 质A色谱工序中的凝聚体形成以外，还进一步尝试了除去该色谱工序中的 凝聚体。