[发明专利]用于通过抑制CYP51基因表达来控制致植物病真菌和卵菌的RNAi

说明书

发明领域

本发明涉及双链RNA(dsRNA)-介导的来自真菌或卵菌植物病原体的一个或一个以上CYP51基因的基因沉默。因此，本发明涉及用于抑制CYP51基因表达的dsRNA分子和这样的抑制性dsRNA分子用于控制致植物病真菌和/或卵菌的用途；为抑制性dsRNA分子或反义RNA提供转录模板的DNA序列；和包含这样的DNA序列的植物病原体-耐受的转基因植物。

发明背景

致植物病真菌和卵菌引起的植物疾病在植物培植中为严重的风险。谷类作物的疾病例如镰孢菌属的致植物病真菌引起的镰孢菌属赤霉病和根腐病对全球谷类产量和谷类工业产生巨大的经济和农学影响。致植物病真菌和卵菌引起的损伤损害农产品的质量和产量，直至颗粒无收，并因此导致显著的经济损失。另外，植物侵染期间致植物病真菌产生的真菌毒素对农产品的污染可危及食品安全并代表对人类和动物健康的一种严重威胁。由致植物病真菌和卵菌引起的惨重损失的风险在当前代表农作物植物生产的主要方法的单作中尤其高。

当前，管理致植物病真菌和卵菌的主要策略包括广泛使用的杀真菌剂的施用、抗性育种策略、生物控制和基因工程。后一种策略依赖于转基因例如几丁质酶、防御素、多聚半乳糖醛酸酶的使用和真菌霉素解毒酶的使用。然而，就农艺实践下的有效性和可靠性而言这种抗真菌性状的使用目前已经不提供令人信服的实际解决方案。

杀真菌剂，例如全身性的DMI(去甲基化抑制剂)，当前对于控制植物疾病例如镰刀菌病以达到现代高产量品种可达到的生产水平必不可少。DMI杀真菌剂，例如戊唑醇、三唑酮和咪鲜胺，通过与细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-脱甲基酶(CYP51)结合来抑制麦角固醇生物合成，其导致真菌膜完整性扰乱(Yoshida:Lanosterol14a-demethylase.In:Schenkman,H.,Grein,K.(编辑),CytochromesP450.Springer-Verlag,Berlin,1993.第627–639页)。然而，自从在20世纪70年代中期发现后对DMI杀真菌剂的严重依赖已经导致在最近几年中出现许多DMI-抗性植物病原体菌株。由于这些原因，致植物病真菌和卵菌引起的植物疾病的控制依然是一个挑战。

RNA干扰，也称为“RNAi”，已经作为加速植物生物技术研究的基因工具出现。RNAi是所有真核生物中存在的基因调节过程的保守组成部分。对于植物中的RNAi，使用替代的术语“转录后基因沉默”(PTGS)。PTGS开始于通过称为Dicer的RNA酶III-样酶(Baulcombe,Nature431:356–363.2004)将前体双链RNA加工或切割为短的、约20-25核糖核苷酸长、单链或双链的干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)(Hamilton&Baulcombe,Science286:950-952.1999)。将siRNA或miRNA掺入识别互补信使RNA(mRNA)分子并将其降解的RNA-诱导沉默复合体(RISC)，因此导致蛋白翻译水平大幅降低，并有效关闭相应基因。

最近描述双链RNA的植物原位表达在真菌细胞中诱导宿主植物-诱导基因沉默(HIGS)。在烟草中，有报道GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因-干扰盒的表达特异性减少植物定植期间在轮枝样镰刀菌(Fusariumverticillioides)的GUS-表达菌株中的转录水平(Tinoc等,BMCBiol.31(8):27.2011)。Nowara等人(PlantCell22:3130-41.2010)制备了表达靶向真菌效应基因Avra10的双链RNA的大麦并报道叶表皮细胞内的功能吸器数目减少。据描述，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)-介导的小麦柄锈菌(Pucciniatriticina)(叶锈病)致病基因丝裂原活化蛋白激酶1(PtMAPK1)、亲环素(PtCYC1)和钙调磷酸酶B(PtCNB)的瞬时沉默部分地抑制小麦中小麦柄锈菌、禾柄锈菌(P.graminis)和条形柄锈菌(P.striiformis)的生长(Panwar等,PlantJ73:521-32.2013)。

本发明的一个目标为提供进一步的基于RNAi的抗真菌和卵菌植物病原体的方法，特别地提供用于在农艺实践中控制这些植物病原体的方法和手段。

发明简述