[发明专利]重组微生物和其使用方法

权利要求书

1.一种修饰的苯丙氨酸tRNA合成酶(PheS)，其使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA，其中所述修饰的PheS在相对于野生型合成气发酵梭菌的氨基酸位置311的氨基酸位置处包括甘氨酸而非丙氨酸；条件是PheS仍然能够执行其所希望的功能；其中所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸。

2.如权利要求1的修饰的PheS，其中所述苯丙氨酸类似物选自DL-4-氯苯丙氨酸、对氯苯丙氨酸、对氟-L-苯丙氨酸、对氟-DL-苯丙氨酸、对溴-L-苯丙氨酸。

3.一种编码权利要求1的修饰的PheS的核酸。

4.一种用于从亲本微生物产生重组微生物的方法，所述方法包括至少以下步骤：

a)用质粒转化亲本微生物，所述质粒包含：

1.编码选自PheS和ThiK的至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列，其中所述PheS在相对于野生型合成气发酵梭菌的氨基酸位置311的氨基酸位置处包括甘氨酸而非丙氨酸，以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA；其中所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸；

2.编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；和

3.与所述亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组；

b)选择表达所述至少一个正向选择标记的一种或多种微生物；和

c)选择不表达所述至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。

5.如权利要求4的方法，其中所述方法还包括针对修饰的PheS的表达进行选择。

6.如权利要求5的方法，其中所述针对修饰的PheS的表达而进行的选择包括在苯丙氨酸类似物的存在下培养重组微生物。

7.如权利要求4的方法，其中所述苯丙氨酸类似物选自DL-4-氯苯丙氨酸、对氯苯丙氨酸、对氟-L-苯丙氨酸、对氟-DL-苯丙氨酸、对溴-L-苯丙氨酸。

8.如权利要求4的方法，其中所述质粒还包括同源臂，所述同源臂允许载体与亲本微生物基因组之间的同源重组。

9.如权利要求4的方法，其中所述质粒还包括有待插入亲本基因组中的至少一个所关注核酸序列。

10.如权利要求4的方法，其中所述质粒还包括正向选择标记。

11.如权利要求10的方法，其中所述方法还包括选择正向选择标记的表达。

12.如权利要求11的方法，其中所述正向选择标记选自CatP、ErmB或TetA。

13.一种ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS在相对于野生型合成气发酵梭菌的氨基酸位置311的氨基酸位置处包括甘氨酸而非丙氨酸，以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA；其中所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸。