[发明专利]对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点

说明书

本申请描述了特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。进一步描述了结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体。进一步描述了用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体。

本发明涉及特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。本发明进一步延伸到结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体(tandemdiabody)。特别是，本发明涉及用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体

EGFR失调与许多癌症相关联，小分子和EGFR靶向抗体均已成功用于临床。然而，由于EGFR的广泛的正常组织表达，被批准用于临床应用的抗体以及那些处于开发中的抗体均具有严重的副作用。具有截短的胞外结构域并确保配体非依赖性固有活性的EGFR的缺失突变体(deletion variant)III(EGFRvIII)，是与致癌性转化相关的最常见的突变体形式。EGFRvIII专门在癌组织中表达，并与各种实体瘤类型相关。癌细胞上受限制的EGFRvIII表达提供了开发专门靶向癌症同时保护正常组织并充分降低与EGFR治疗相关的副作用的细胞毒性抗体的机会。

在本发明的第一个方面中，本文描述了全人的、高特异性的、高亲和力EGFRvIII结合蛋白。所描述的EGFRvIII结合蛋白具有如下优势：

它们不促进或促进来自靶向阳性分子的细胞表面的非常低的EGFRvIII内化，这有利于募集细胞毒性T-细胞或NK-细胞。图9中的结果显示，根据本发明，细胞在所有测试条件下暴露于EGFRvIII结合蛋白之后，相对于未处理的细胞，EGFRvIII受体分子仍保留在细胞表面上。这些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3结合蛋白令人惊讶地不显示任何内化趋势(图9)。本发明的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可能促进EGFRvIII表达的增加，从而导致其细胞表面密度增加。

可使用亲和力成熟技术(affinity maturation technique)使这些高亲和力结合蛋白的亲和力得到进一步大幅提高以获得对EGFRvIII有特异性、K_D在100pM范围或更低的结合蛋白。令人惊讶的事实是，这些结合蛋白展示了结合EGFRvIII的异常特异性，且对天然EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)没有交叉反应性。由于来自EGFR细胞外结构域(外显子2-7)的269个氨基酸的框内(in-frame)缺失，因此相对于EGFRwt，在EGFRvIII中形成新表位(neo-epitope)，且预计该新表位相当小：其由新的氨基酸并列(novel juxtaposition of aminoacids)(氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。

亲和力成熟筛选方法的目的在于通过促进解离速率(k_OFF)降低的结合蛋白的选择来提高结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所显示的亲和力成熟的结合蛋白大大增加了结合速率(k_ON)，而k_OFF的降低对结合蛋白的提高达100倍的结合仅有小的贡献，其中一些可变抗体结构域显示K_D小于100pM。

这些独特的性质使这些本文所描述的对EGFRvIII有特异性的可变抗体结构域特别适用于开发多特异性的，例如双特异性的、多价的、免疫效应细胞参与(immune effectorcell engaging)、肿瘤靶向抗体治疗，诸如，例如EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体

在本发明的进一步方面中，提供了多价EGFRvIII结合抗体，其对EGFRvIII具有两个结合位点，或在多价双特异性抗体的情况下，除对EGFRvIII具有两个结合位点之外，还对T-细胞抗原CD3或特异性表达于天然杀伤(NK)细胞上的CD16A具有结合位点。