[发明专利]经由剪刀状结构的DNA扩增(DASL)

说明书

提供了通过具有链置换活性的聚合酶扩增目标核酸的方法和系统，其使用两种或更多种茎环状引物，每种茎环状引物具有3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分包括与目标核酸的目标同源性位点互补的序列，所述5’末端部分具有包括茎序列，环序列和与所述茎序列反向互补的序列的序列，所述5’末端部分能够形成茎环。这种方法和系统可以用于通过具有链置换活性的聚合酶等温地扩增目标核酸。

技术领域

本发明涉及核酸扩增。更具体地，本发明涉及使用新颖的引物和扩增设计来扩增核酸的方法和系统。

背景技术

核酸扩增通常用于研究、鉴证、医学(包括诊断)和农业。其中最著名的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)，这是一种目标扩增方法(参见美国专利号4683195、4683202和4800159)。PCR反应通常利用两种引物和DNA聚合酶，所述两种引物结合到目标核苷酸序列的5’末端和3’末端，所述DNA聚合酶通过使用三磷酸脱氧核苷(dNTPs)增加碱基来延伸所结合的引物以产生双链产物。通过提高和降低反应混合物的温度，将DNA产物的两条链分离并作为下一轮引物结合和延伸的模板，并重复该过程。PCR需要热循环仪器以升高和降低温度，因此在一些快速和现场测试设置中受限。

在过去的几年里已经开发了等温环境中的目标扩增方法。一种是链置换扩增(SDA)。SDA结合了限制性内切酶使目标DNA的未修饰的链产生切口的能力以及外切酶缺陷的DNA聚合酶延伸切口处的3’末端并置换下游DNA链的作用。置换链充当互补链反应的模板，反之亦然，从而导致目标DNA的扩增(参见美国专利号5455166和5470723)。在原始设计的SDA中，首先通过限制酶切割DNA，以便产生具有确定的5’和3’末端的可扩增目标片段，但限制酶切割位点的要求限制了可能的目标DNA序列的选择(参见例如，Walker et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396(1992))。通过加入位于待扩增的区域的侧翼的保险杠(bumper)引物来进一步发展SDA(Walker等人，见上(1992)，美国5916779)。SDA技术已主要用于传染病例如衣原体和淋病的临床诊断。然而，SDA在迅速扩增序列方面效率低下。

另一种等温扩增系统，转录介导的扩增(TMA)，使用RNA聚合酶的功能以从在引物区域中设计的启动子制备RNA，以及使用逆转录酶的功能以从RNA模板产生DNA。通过引入第三酶活性，RNase H，以在不进行热变性步骤的情况下从cDNA除去RNA而进一步发展了RNA扩增技术。因此，已经消除了热循环步骤，产生命名为自持序列复制(3SR)的等温扩增方法(参见，例如，Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878(1990))。然而，TMA和3SR的起始物限于RNA分子，并且不能是DNA。

第三种等温目标扩增方法，滚环扩增(RCA)，生成在改编自体内滚环DNA复制的体外DNA扩增中使用的序列的多个拷贝(参见Fire and Xu,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4641-4645(1995)；Lui,et al.,J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594(1996)；Lizardi,et al.,Nature Genetics 19:225-232(1998)，美国专利号5714320和6235502)。DNA聚合酶延伸环状模板上的引物，产生所述模板的互补序列的串联连接的拷贝(参见Kornberg and Baker,DNA Replication,W.H.Freeman and Company,New York(2nd ed.(1992))。最近，RCA在命名为多重置换扩增(MDA)的技术中得到了进一步的发展，其产生全基因组扩增的更一致表现(参见Dean et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-5266(2002))。然而，这些方法使用不方便，因为需要产生环状模板作为程序的一部分。