[发明专利]去除污染物的方法

说明书

本发明提供一种用于纯化Apo A‑I的方法，其包括提供包含Apo A‑I和盐酸胍的溶液并通过具有从15nm至35nm的孔径范围的过滤器过滤该溶液从而减少Apo A‑I的病毒污染的步骤。本发明提供一种Apo A‑f制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV；和/或针对脂质包膜病毒具有至少8.5log的LRV。本发明还提供包含Apo A‑I的药物组合物和重构的高密度脂蛋白制剂以及用于治疗疾病、紊乱或病况的方法。

技术领域

本发明涉及一种用于纯化载脂蛋白的方法，特别是用于从含有载脂蛋白A-I(ApoA-I)的溶液去除病毒病原体的方法，并涉及提供一种Apo A-I制备物。

背景技术

载脂蛋白是可溶性脂蛋白复合体中的主要蛋白质组分，载脂蛋白A-I(ApoA-I)为高密度脂蛋白(HDL)颗粒的主要蛋白质组分。

载脂蛋白的A、C和E家族由共同的祖先基因进化而来，它们在结构上是相似的。这些蛋白质分子一般含有一系列22-氨基酸串联重复，其常常被脯氨酸残基分隔开。重复的22-氨基酸节段形成两亲性的α-螺旋，其能够既与脂质结合又与水表面结合。在人Apo A-I(243个氨基酸；28.1kDa)的情况下，有八个22聚体和两个11聚体的两亲性螺旋(Lund-Katz&Phillips,2010,Subcell Biochem.51,183-227)。载脂蛋白的两亲性的α-螺旋在稳定脂蛋白中起着关键性的作用。它们通过定向载脂蛋白来做到这一点，使得主要疏水性的螺旋面能够与复合体中的疏水性脂质发生相互作用，而载脂蛋白的主要亲水性的相对面与周围含水环境发生相互作用。但是，当这些蛋白质与脂质组分分开时，疏水性氨基酸残基暴露于含水环境可使它们变得难以处理。特别是α-螺旋的疏水面具有自缔合的倾向，其导致聚集体形成和在一些条件下发生沉淀。例如，据估计，当被存储于pH 7.4的50mM磷酸盐缓冲液中时，1mg/mL含有Apo A-I Milano的溶液含有80％的聚集形式的蛋白质(Suurkuusk&Hallén,2002,Spectroscopy 16,199-206)。

Apo A-I由肝脏和小肠合成并负责HDL在血液中的生理功能；通过被称为“反向胆固醇运输”(RCT)的机制从外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白。结果，HDL颗粒以一系列尺寸存在于血浆中，并由于这些RCT脂质运输活性而不断重构。因此，HDL颗粒的特征在于高密度(>1.063g/ml)并且尺寸范围为大约5至20nm(斯托克斯直径)。根据流行病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏疾病(CHD)的发展之间的明显的相关性已被多次证实。因此，HDL中的Apo A-I被认为具有抗炎功能并抑制CHD的发生和发展。此外，Apo A-I已经显示出降低血液中低密度脂蛋白(LDL)水平和已知与脂多糖或内毒素结合，从而在HDL的抗内毒素功能中具有主要作用。HDL和作为其主要蛋白质组成的ApoA-I的“保护性”的作用已在多项研究中被证实。Apo A-I的高血浆水平与CHD和冠状动脉病变存在的降低的风险有关。因此，Apo A-I有希望应用于像重构的HDL的药物，其用于在急性冠脉综合征、动脉粥样硬化治疗、抗炎治疗、抗毒素治疗、肝靶向药物等中的应用。

通常使用生物学原料制造重组或血浆来源的生物学药物，所述生物学原料被固有地污染有诸如病毒的病原体。此外，一些制造方法由于其性质容易受到来自外部来源的病原体污染。因此，需要生物学药物的制造商向他们的制造方法中引入足够的病毒清除步骤，以确保他们的产品不含污染物。

用重组DNA在细胞培养物、转基因动物或转基因植物中生产生物技术产品(通常为蛋白质或DNA)。生产中使用的常见细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、大肠杆菌细菌和酵母。通常以分批模式实施基于细胞的生产系统，然而也在使用少量灌注系统。主要以基于CHO的8,000–25,000L规模的发酵器在1,000–100,000L的规模进行最终商业规模的发酵。