[发明专利]AXMI422毒素基因及其使用方法

说明书

在此提供了用于向细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包括针对毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用在用于在植物和细菌中转化和表达的DNA构建体或表达盒中。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。具体地说，提供了分离的毒素核酸分子。另外，涵盖了与这些多核苷酸相应的氨基酸序列、以及与这些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体地说，本发明提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包含对SEQ ID NO:2‑3中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列、或在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列、以及其变体和片段。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖的基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品中以及在生产转基因抗有害生物植物中是有用的。

发明背景

苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性产芽孢土壤细菌，其特征在于其产生晶状内含体的能力，所述晶状内含体特异性地对于昆虫的某些目和种具有毒性，但对于植物和其他非靶生物是无害的。因此，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白质的组合物可用作环境上可接受的杀昆虫剂以用于控制农业昆虫有害生物或者各种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目、半翅目、双翅目、以及鞘翅目幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白还已经显示针对膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及蜱螨亚纲有害生物目(Acari pest order)、连同其他无脊椎动物目(如线虫动物门、扁形动物门、以及原生动物门肉鞭毛虫亚门)的活性(费特逊(Feitelson)(1993)苏云金芽孢杆菌家族树(The Bacillus Thuringiensis family tree).先进的工程杀有害生物剂(Advanced Engineered Pesticides)，马塞尔穧德克尔格式(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州(N.Y.))。这些蛋白最初主要基于它们的杀昆虫活性而分类为CryI至CryV。这些主要的类别是鳞翅类特异的(I)、鳞翅类与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)与(VI)。这些蛋白质进一步分类成亚家族；在每个家族内更高度相关的蛋白质被指定了分组字母例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等等。在每个分组内更加密切相关的蛋白质被给予诸如Cry1C1、Cry1C2等的名称。

基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(克里克莫尔(Crickmore)等人(1998)微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。在此分类中，每种毒素被指定了独特的名称，其中包括第一级(primary rank)(阿拉伯数字)、第二级(secondary rank)(大写字母)、第三级(tertiary rank)(小写字母)、以及第四级(quaternary rank)(另一个阿拉伯数字)。在第一级中，罗马数字已被换成阿拉伯数字。具有低于45％的序列一致性的蛋白质具有不同的第一级，第二和第三级的标准分别为78％和95％。

晶体蛋白不展示杀昆虫活性，直至其被摄取并溶解在昆虫中肠之中。被摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(和怀特利(Whiteley)(1989)微生物学评论(Microbiol.Rev.)53:242-255)。这种毒素与靶幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见，例如戴马格德(de Maagd)等人(2001)遗传学趋势17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β片层组成并且结构域III由“果冻卷”结构中的两个反向平行的β片层组成(de Maagd等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。