[发明专利]用于制备唾液酸衍生物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于制备唾液酸衍生物的方法，其特征在于在一个反应器中将从N-乙 酰-D-葡糖胺(GlcNAc)制备CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的过程和包含结合唾液酸与 包含半乳糖的衍生物如乳糖等的唾液酸(神经氨酸)衍生物制备过程一起进行。

背景技术

糖(自然界中最为广泛和大量存在的一种生物分子)是参与细胞内识别和信号转 导的最常见的分子。当通过核酸活化时，大部分糖组成单元可加至苷元。核苷酸-糖具有单 糖的活化形式，并用作糖基转移酶转糖基反应的供体。然而，该转糖基作用仍具有糖基转移 酶反应性弱、活化多糖组成单元使用受限等问题。

近来，由于针对糖链结构和功能的研究已快速开展，包含低聚糖、糖脂、糖蛋白等， 具有生理学活性的糖链作为药物或功能材料的用途开发已积极开展。其中，在末端包含N- 乙酰神经氨酸(NeuAc)的含唾液酸糖链是具有细胞粘附重要功能或用作病毒感染受体等的 糖链。

含唾液酸糖链通常通过唾液酸转移酶的催化合成。唾液酸转移酶是使用CMP-N-乙 酰神经氨酸作为糖供体，将唾液酸转移至受体例如糖链等的酶。然而，事实上，用作糖供体 的CMP-N-乙酰神经氨酸是显著昂贵的且对应于试剂级的仅少量供有。

作为制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，使用5'-三磷酸胞苷(CTP)和N-乙酰神经氨 酸(NeuAc)作为底物并通过CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶的合成方法是已知的。然而，因为 CTP和NeuAc为昂贵原料，所以通过直接使用原料而合成的CMP-N-乙酰神经氨酸也是昂贵 的。

作为制备CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的方法，以下方法已被报道：(1)使用 N-乙酰神经氨酸裂解酶或N-乙酰神经氨酸合成酶由N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)制备CMP- NeuAc的方法(J.Am.Chem.Soc.，110:6481，1988；J.Am.Chem.Soc.，110:7159，1988；日本专 利申请公开号Hei10-4961)，(2)通过在碱性条件下将N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)转化为N- 乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，并往其中加入N-乙酰神经氨酸裂解酶或N-乙酰神经氨酸合成 酶而制备N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的方法(日本专利申请公开号Hei5-211884； Biotechnol.Bioeng.，66:2，1999；EnzymeMicrob.Technol.，20，1997)，(3)使用N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)2-差向异构酶将GlcNAc催化转化为ManNAc，并使用N-乙酰神经氨酸裂解酶或 N-乙酰神经氨酸合成酶以由N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)制备NeuAc的方法(WO95/26399；日 本专利申请公开号Hei3-180190；日本专利申请公开号2001-136982)，(4)使用大肠杆菌和 酵母细胞合成CMP-N-乙酰神经氨酸的方法等。

然而，所述方法(1)具有N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)为昂贵原料的问题，且所述 方法(2)具有从GlcNAc和N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)的混合物纯化ManNAc的过程极度复 杂的问题，即便N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)为廉价原料。此外，因为方法(3)中使用的 GlcNAc2-差向异构酶需要ATP(三磷酸腺苷)，所以方法(3)具有需要加入昂贵的ATP或使用 微生物从ATP前体腺嘌呤产生ATP的问题。方法(4)具有就过程而言，大肠杆菌(E.coli)和酵 母细胞的使用复杂的问题。

韩国专利申请公开号10-2006-0010706公开了用于制备CMP-N-乙酰神经氨酸的以 下方法：通过将5’-单磷酸胞苷(CMP)、N-乙酰-D-葡糖胺、丙酮酸盐(丙酮酸钠)和酵母加至 引入了包含编码N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶的基因和编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因 的共表达载体的转化株以由此合成神经氨酸，并进一步加入CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶， 或将5’-单磷酸胞苷(CMP)、N-乙酰-D-葡糖胺、丙酮酸盐和酵母加至引入了包含编码N-乙酰 神经氨酸醛缩酶的基因和编码CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶的基因的共表达载体的转化株。 然而，该方法具有以下问题：CMP-N-乙酰神经氨酸的制备中需要进行各种步骤，且由用作底 物的5’-单磷酸胞苷(CMP)至5'-三磷酸胞苷(CTP)的转化率低。