[发明专利]用于从阿魏酸快速和高产率产生香草醛的恶臭假单胞菌KT2440的基因工程化

说明书

本发明涉及基于基因工程假单胞菌菌株从阿魏酸产生香草醛的改进的生物催化方法，以及涉及所述假单胞菌菌株。

本发明涉及基于基因工程假单胞菌菌株从阿魏酸产生香草醛酸的改进的生物催化方法，以及涉及所述假单胞菌菌株。

技术背景

香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，香草兰香料的感官化合物，是全世界数量上最广泛使用的调味剂之一。其需求量长久以来超过植物源香草兰(Vanilla planifolia)的供应量。目前，大部分香草醛从愈创木酚(源自化石原料)和木质素(来自木浆业的废料中的组分)化学地合成(Ramachandra Rao和Ravishankar，2000)。然而，对这种“等同天然的”香草醛(大多用于食物和饮料工业中)的需求转向“天然”香草醛，原因在于消费者的健康和营养意识不断上升。因此，生物技术生产“天然”香草醛变得越来越重要(综述见Krings和Berger，1998；Priefert等人，2001)。

已经尝试通过体外培养的香草兰细胞产生香草醛(Davidonis和Knorr，1991)。还使用基因修饰的酵母株实施从头合成(Hansen等人，2009)。然而，主要重点放在使用分离的酶或不同原核微生物作为完整细胞生物催化剂的生物转化方面(Havkin-Frenkel和Belanger，2008；Berger，2009)。

除了木质素和酚类芪如丁香酚外，阿魏酸生物转化成香草醛是研究最充分的产生“天然”香草醛的方法(综述见Rosazza等人，1995；Priefert等人，2001)。前体阿魏酸(3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)丙-2-烯酸)(一种羟基肉桂酸)，是高度丰富的物质，原因在于它是许多植物细胞壁的组分(Ishikawa等人，1963；Escott-Watson和Marais，1992；Ishii，1997；Oosterveld等人，2000)。已经评价了用于从阿魏酸产生香草醛的许多不同微生物，包括大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas ssp.)、红球菌属(Rhodococcus ssp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、朱红秘孔菌(Pycnoporouscinnabarinus)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis ssp.)和链霉菌属(Streptomyces ssp.)的重组菌株(Lesage-Meessen等人，1996；Okeke和Venturi，1999；Muheim和Lerch，1999；Achterholt等人，2000；Overhage等人，2003；Peng等人，2003；Plaggenborg等人，2006；Yoon等人，2007；Barghini等人，2007；Hua等人，2007；Di Gioia等人，2010；Tilay等人，2010；Fleige等人，2013)。然而，在大多数情况下，香草醛产率低并且生物转化反应缓慢。低产率可以大多归因于香草醛的高度毒性(Krings和Berger，1998)。用吸附剂树脂增强香草醛的产生改进了香草醛水平直至19.2g l^-1，但是约43％的摩尔产率相当低(Hua等人，2007)。其他缺点是异源基因表达低效和质粒不稳定。重点还关注防止香草醛进一步降解成香草醇或香草酸(Stentelaire等人，1997；Bonnin等人，1999；Oddou等人，1999；Civolani等人，2000；Overhage等人，2000)。