[发明专利]蛋白酶抗性肽配体

说明书

相关申请的交互引用

本申请要求2013年7月15日提交、Menegatti等、代理所案号 NS13002USV的美国临时申请号61/846326“蛋白酶抗性肽配体 (PROTEASE-RESISTANTPEPTIDELIGANDS)”的权益，该申请在 此通过引用整体并入。

1.发明领域

本发明总体上涉及新型蛋白酶抗性肽配体的发现。

2.背景技术

1.介绍

从哺乳动物血清纯化免疫球蛋白用于治疗和研究应用是一件具有 相当大的工业、医学和经济价值的事情。基于多克隆抗体的疗法表现 出针对多个表位和靶点的多价交互作用，因此最适合用于预防或治疗 某些疾病。血浆来源的多克隆静脉注射免疫球蛋白(IVIG)制剂已经 成功地用于预防免疫缺陷患者中的感染性疾病并对自身免疫和炎性问 题得到了越来越多的应用。至今，IVIG是全球血液产品市场上的主要 血浆产品，每年的消耗量稳步增加。目前源自动物血浆的多克隆抗体 也用于产生免疫测定法的研究并用于设计治疗和诊断工具。

目前对来自哺乳动物血清的多克隆抗体的亲和纯化主要基于使用 蛋白配体，例如蛋白A和蛋白G。然而，这些蛋白配体面临几个缺点， 例如1)成本高(每升吸附剂$15,000–20,000)，2)化学和生物化学稳 定性低，3)免疫原性，伴随着与在产品主流中配体片段的浸出相关的 风险，和4)由于高结合亲和性造成的苛刻的洗脱条件，其威胁洗脱蛋 白的生物活性。此外，蛋白A并不结合人类IgG3和几种动物的免疫球 蛋白。蛋白G尽管结合所有人类IgG亚类，但也显示出相当多地结合 白蛋白，一种在人类和动物血浆及其级分中的主要蛋白。

为克服这些问题，已经提议用基于肽、氨基酸、三嗪支架和嗜硫 化合物的合成配体用于纯化抗体。我们的研究小组已经鉴定出三种六 肽配体，HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQIDNO:1-3)，其通 过Fc部分结合IgG，从而模拟蛋白A的结合机制。特别是，肽HWRGWV 被进一步表征为具有从多种复杂来源分离IgG的能力，所述复杂来源 包括细胞培养基、CHO细胞培养上清液、转基因奶和乳清、植物提取 物、和人类血浆的Cohn级分II+III。从这些实验得到的产物收率和纯 度总是与通过蛋白A介质获得的相当。

然而，当用于从人类血浆纯化多克隆抗体时蛋白配体和合成肽配 体二者所面临的一个问题是在人类血浆中存在的蛋白水解酶、尤其是 胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的作用。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶， 其在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧切开肽链。胰凝乳蛋白酶在疏水性 残基例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基侧切开肽链。在长期暴露 和/或反复接触哺乳动物血清后，蛋白或肽配体都会被这些内切蛋白酶 所降解。为防止蛋白A被这些内切蛋白酶所降解以及由此引起的昂贵 的亲和树脂寿命的减少，在注射前要向进料添加酶抑制剂。然而，这 些抑制剂本身也是一笔相当大的额外成本。

3.发明内容

在具体的非限制性实施方式中，本发明提供了一种具有三到二十 个氨基酸的蛋白酶抗性肽，其能够结合生物制品并包含一个或多个碱 性氨基酸和/或芳香族氨基酸，其中一个或多个氨基酸被非天然存在的 氨基酸类似物替换。所述非天然氨基酸类似物可以是表6中所列之一。

蛋白酶抗性肽可以是4聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9 聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚 体、17聚体、18聚体或19聚体。蛋白酶抗性肽是六肽，在被非天然 存在的氨基酸替换前序列为HWRGWV、HYFKFD和HFRRHL(SEQID NO:1-3)

蛋白酶抗性肽可以具有1个非天然存在的氨基酸。可选地，其可 以具有2、3、4、或5个非天然存在的氨基酸。所述肽可以具有10分 之1的被非天然存在的氨基酸替代的氨基酸(10％)。可选地，其可以 具有19分之1的被替代的氨基酸(～5％)。其可具有10分之2的被 替代的氨基酸(20％)或6分之2的被替代的氨基酸(33％)。其可以 是50％的非天然存在的氨基酸，例如6分之3，或8分之4等。