[发明专利]突变型因子VIII组合物和方法

说明书

技术领域

本申请要求享有于2013年6月24日提交的顺序号为61/838867的美国临时专利申请的优先权。上述申请的全部内容在此通过引用的方式并入本文。

本发明涉及相比相应的野生型人因子VIII显示出更高的表达水平的重组人因子VIII突变体。本发明还涉及制备和使用重组人因子VIII突变体的方法。

政府许可权

本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号HL084381的美国政府支持下作出的。美国政府因此对本发明具有一定许可权利。

背景技术

血友病A，是最常见的严重的遗传性出血性疾病，由血浆蛋白因子VIII的缺乏或缺陷引起。在患有血友病A的患者中，当血友病患者受伤时，血液不正常凝结导致出血过多。治疗方法由使用(纯化的)血浆或重组蛋白制品的替代疗法组成。

当血小板附着到受伤血管的切口壁时，在受损部位凝血开始。随后，在酶调节的反应的级联中，可溶性纤维蛋白原分子通过酶凝血酶被转变为使血小板聚集在血栓中的纤维蛋白的不溶性丝。在级联中的每一步，蛋白前体被转变为在系列中切割下一个前体蛋白的蛋白酶。在大多数步骤中需要辅因子。

因子VIII作为非活性的非共价的金属离子依赖性异源二聚体前体在血液中循环，紧密和非共价地结合vonWillebrand因子。蛋白质的这种procofactor形式包含由A1(a1)A2(a2)B结构域组成的重链(HC)和由(a3)A3C1C2结构域组成的轻链(LC)，小写字体a代表酸性残基中富含的短(～30-40个残基)片段。因子VIII是在由凝血酶或因子Xa催化的A1A2、A2B和A3A3结点通过溶蛋白性裂解而蛋白水解活化的，这用来使其与vonWillebrand因子分离并在级联中活化其促凝血功能。在其活性形式，所述蛋白质因子VIIIa是在酶原因子X向丝氨酸蛋白酶(因子Xa)的膜依赖性转变中将丝氨酸蛋白酶因子IXa的催化效率以几个数量级增加的辅因子。

基因疗法已经被提出作为治疗方式用于补充在血友病患者中的凝血因子缺乏，并且已经尝试设计适合于治疗人类的FVIII构建体。例如，Connelly等人报道用编码人FVIII的腺病毒载体治疗FVIII缺乏小鼠导致生物活性的人FVIII的表达(Connelly等人，Blood，第91卷，第9期(1998)，第3273-3281页)。Sarkar等人报道在小鼠模型中与FVIII组合使用AAV8血清型修正血浆FVIII活性(Sarkar等人，Blood，第103卷，第4期(2004)，第1253至1260页)。

然而，如在基因疗法的许多方面中，理论要比成功有效的实施简单得多。实施基因疗法技术的困难包括在使用病毒作为基因载体和FVIII的表达水平不足所遇到的问题。例如，人FVIII分泌非常低效且产率相比相似的蛋白质(如因子V)以对数形式降低。此外，虽然病毒作为基因载体是有效的，因为它们可以用于转导细胞导致体内蛋白质表达，但是包被病毒颗粒的蛋白质可以激活机体的免疫系统。

因此，鉴于上述情况，需要可以有效地表达足够量的靶FVIII蛋白以将病毒载体的所需剂量减少到可接受的水平。

发明内容

概要

本发明提供修饰的因子VIII(FVIII)蛋白、编码FVIII的核酸和FVIII表达载体，以及在FVIII缺乏(如血友病A)的治疗中使用所述修饰的FVIII基因的方法。

在一个方面，本发明提供了一种相比野生型因子VIII具有增加的表达或分泌的突变型人因子VIII。

在一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括选自I86、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147、L152和其组合中的一个或多个氨基酸取代。

在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括选自I86V、Y105F、A108S、D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T、L152P和其组合中的一个或多个氨基酸取代。

在另一个实施方式中，所述重组突变型人因子VIII包括I86、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和L152各氨基酸的氨基酸取代。