[发明专利]改进的NGS工作流程

权利要求书

1.一种制备DNA文库的方法，其包括下述步骤：

a)从样品提取核酸，

b)使提取的核酸暴露于混合物，所述混合物包含UDG，DNA聚合酶和任选地逆转录酶，和dUTP，

c)孵育所述混合物以便消除混合物中来源于之前的扩增反应的残留扩增产物的污染，

d)在dUTP存在的情况下执行扩增反应，其中所述去污染反应，任选地逆转录和DNA聚合酶实施的扩增反应在相同反应混合物中执行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶是栖热水生菌(Thermusaquaticus,Taq)DNA聚合酶或者其功能衍生物，其中Taq聚合酶的功能衍生物具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少100％的Taq聚合酶的DNA聚合活性。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述提取的核酸在步骤b)之前片段化。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述DNA文库随后用于下一代测序反应。

5.试剂组合物，其包含酶混合物，所述酶混合物包括UDG、DNA聚合酶，任选地逆转录酶。

6.根据权利要求5所述的试剂组合物，其进一步包括dUTP。

7.包含TaqDNA聚合酶或其功能性衍生物的试剂组合物。

8.包含用于逆转录和/或PCR的试剂的试剂组合物。

9.消除用于核酸模板扩增的反应混合物中污染的方法，所述反应混合物包括所述核酸模板、DNA聚合酶、UDG酶和任选地逆转录酶，和dUTP，以及用于DNA聚合反应并且任选地逆转录的试剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述UDG酶灭活一段时间，所述一段时间足以消除混合物中来源于先前扩增反应的残留扩增产物的污染。

11.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶是栖热水生菌(Taq)DNA聚合酶或其功能衍生物。

12.根据权利要求9到11中任一项所述的方法，其中所述提取的核酸在步骤b)之前片段化。

13.根据权利要求9到12中任一项所述的方法，其中所述DNA文库随后用于下一代测序反应。

14.一种用于制备DNA文库的方法，所述方法包括下述步骤：

a)从样品提取核酸，

b)使提取的核酸暴露于混合物，所述混合物包含DNA聚合酶和任选地逆转录酶，

c)在dUTP存在的情况下执行扩增反应

d)将获得的扩增产物标准化，其中所述标准化方法包括下述步骤：

(ⅰ)添加包含碱金属盐和溶剂的缓冲液组合物到包含扩增产物的扩增混合物，

(ⅱ)添加载体颗粒到包含扩增产物的扩增混合物，

(ⅲ)使所述混合物孵育一段时间，所述时间足以使DNA结合到载体颗粒，

(ⅳ)使用乙醇清洗所述混合物，

(ⅴ)从载体颗粒洗脱标准化的PCR产物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述碱金属盐是NaCl。

16.根据权利要求14和15中任一项所述的方法，其中所述溶剂是聚乙二醇。

17.根据权利要求14到16中的任一项所述的方法，其中以约2.0到约5.0MNaCl，优选约2.5MNaCl的量添加所述碱金属盐。

18.根据权利要求14到17中任一项所述的方法，其中所述溶剂是PEG8000。