[发明专利]用于无标记检测DNA、MICRO-RNA和DNA/RNA结合生物标志物的交换诱导剩余磁化

说明书

一种使用交换诱导剩余磁化(EXIRM)技术来无标记地检测短链核苷酸和癌症生物标志物(例如DNA链和microRNA链、DNA/RNA结合生物标志物和癌特异性抗原)的方法，其具有高灵敏度、高特异性和宽动态范围。所述方法可提供一种旨在促进高可靠性且需要最小量的生化试剂的无标记方法。

技术领域

本公开内容涉及miRNA分析(profiling)和生物标志物检测领域。

背景技术

核苷酸是形成核酸(DNA和RNA)的结构单元(building block)和用于携带细胞内能量包(ATP)的生物分子。核苷酸以三磷酸核苷(ATP、GTP、CTP和UTP)的形式在代谢中发挥核心作用。此外，核苷酸参与细胞信号传导(cGMP和cAMP)且被掺入酶促反应的重要辅因子(例如辅酶A、FAD、FMN、NAD和NADP⁺)中。核苷酸也可包含合成序列，以及包含对核苷酸结构的化学修饰以产生例如核苷酸类似物。

DNA和RNA是生命必不可少的生物分子。遗传信息被编码为特定序列的DNA分子。通过信使RNA，信息在转录和蛋白质合成的过程中传递着。因此，它们密切相关的，并与多种类型的疾病(例如癌症)相互影响。

特别地，miRNA在基因调控中发挥重大作用，因此是一类主要的用于癌症诊断的生物标志物。由于他们的短链和多样的表达水平，实现精确和定量检测在技术上仍然具有挑战。miRNA是含有18至25个核苷酸的短的RNA链，发挥许多重要的作用，包括在基因表达、发育和细胞分化中的那些作用(1-3)。成熟的miRNA并入RNA诱导的沉默复合物中，所述复合物基于部分序列互补性与信使RNA结合并由此导致对蛋白质翻译的抑制。miRNA的调控作用取决于miRNA的序列、表达水平以及与其他miRNA的合作。因此，灵敏且特异性地检测miRNA是理解miRNA在蛋白质合成、细胞死亡中的作用以及其作为疾病的生物标志物作用的一个必要步骤。

已经使用了一系列技术来进行miRNA分析。已知的方法包括northern印迹(4)、逆转录聚合酶链式反应(5)、原位杂交(6)、微阵列(7)、生物发光(8)、表面等离子体共振(9)、表面增强拉曼光谱(10)、电化学检测(11)、荧光(12)和光子学方法(13)；然而，没有一种技术可单独地实现高灵敏度、单碱基特异性以及宽动态范围。此外，由于在分析中涉及许多步骤和多种方案(14)，当比较来自不同技术的结果时，重现性仍然是一个显著问题。因此，在该领域对可检测短核苷酸序列(例如miRNA)的具有高灵敏度、高特异性以及宽动态范围的单一技术具有未能满足的需求，该单一技术可以是促进高可靠性且需要最小量的生化试剂的一步法。

因此，产生能够精确检测短核苷酸序列(DNA或RNA序列，例如miRNA)的具有高灵敏度、高特异性以及宽动态范围的方法将特别受欢迎，并且认为本文提出的方法的实施方案通过使用交换诱导剩余磁化(exchange-induced remnant magnetization，EXIRM)技术(15)克服了上文所述的某些局限性。此外，许多癌症生物标志物可特异性地与短链DNA结合，例如前列腺特异性抗原(16)。可直接改进EXIRM方法以实现对这类癌症生物标志物的灵敏且无标记的检测。

实施方案概述

本公开内容涉及一种使用交换诱导剩余磁化(EXIRM)技术来检测短链核苷酸的方法，所述短链核苷酸例如为包括脱氧核糖核酸(DNA)的短链核苷酸；以及包括核糖核酸(RNA)(包括microRNA(miRNA))的短链核苷酸，所述方法具有高灵敏度、高特异性以及宽动态范围。此外，本文描述的方法也可以是促进高可靠性且需要最小量的生化试剂的一步法。2013年4月10日提交的美国临时申请序列号61/810,575通过引用全部并入本文。