[发明专利]融合蛋白酶

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白表达和蛋白化学的技术领域，其中由融合蛋白释放成熟蛋白。

背景技术

重组蛋白技术使得能够生产大量的可用于其生物活性的所需蛋白。这种蛋白通常表达为微生物宿主细胞中的重组融合蛋白。成熟蛋白(目标蛋白)通常与融合伙伴蛋白或较小的氨基酸延伸连接，以便提高表达水平、提高溶解性、促进蛋白折叠或促进纯化和下游加工。

对于维持蛋白的完整生物活性以及药物调节目的，由融合蛋白除去融合伙伴蛋白以释放具有天然N-和C-末端的成熟蛋白可能是关键的。

目前，少数可用于由融合蛋白除去融合伙伴蛋白的蛋白酶可用作用于工业用途的经济上可持续的酶，该蛋白酶在释放的成熟靶蛋白中留下天然N-末端。

一种这样的酶是肠激酶，然而，其缺少特异性而难以广泛应用。其它的这样的酶有因子Xa、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、凝血酶、TEV或鼻病毒3C蛋白酶，它们均要么缺少特异性，因为大多数蛋白包含内部二次切割位点，要么在成熟蛋白的C-或N-末端留下氨基酸延伸。

Waugh,ProteinExpr.Purif.80:283-293(2011)公开了用于除去亲和标签的酶试剂的综述。

WO92/10576公开了在药物制剂中使用具有DPPIV可切割的延伸肽部分的融合蛋白。

Xin,ProteinExpr.Purif.2002,24,pp530-538公开了用于由重组蛋白除去N-末端Pro-Pro的来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的X-脯氨酰基二肽基氨肽酶在大肠杆菌(Escherichiacoli)中的克隆、表达以及应用。

Bülow,TIBTECH9:226-231(1991)公开了一种通过基因融合来制备双功能酶的方法。

Seo,Appl.Environ.Microbiol.2000,66,pp2484-2490公开了一种海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶的双功能融合酶。

在制药工业，蛋白药物目前构成竞争市场的相当部分，因此，需要大规模制造这些蛋白药物的高效方法。融合蛋白的工业用途的关键问题仍然是由融合蛋白除去融合蛋白伙伴以释放完整的成熟蛋白。

因此，需要一种工业方法，其特异性地除去融合伙伴蛋白，而不成熟蛋白中具有内部切割位点，且不在成熟蛋白上留下任何氨基酸延伸。优选地，该融合伙伴蛋白的除去是使用在工业方法中容易制备的仅单一酶进行。同样需要这样的方法，其可在温和的加工条件下对众多不同的蛋白起到该作用，以防止非计划的成熟蛋白的化学和物理变化。

概述

本发明的一个目的在于，提供一种用于由融合蛋白提供成熟蛋白的简单的一步方法。

小RNA病毒3C蛋白酶和Xaa-Pro-二肽基氨肽酶(XaaProDAP)均是非常特异的酶，其表现出被发现可用于制造蛋白药物的互补活性。然而，作为蛋白水解酶，它们还引起在融合成为一种双功能融合蛋白酶时自我切割方面的问题。

由于两种酶物理上靠近并因此副反应更少，在融合蛋白酶中组合两种酶可具有有利的反应动力学的优点。在融合蛋白酶中组合两种酶还具有的优点是，仅需要提供和使用一种试剂。由于尺寸更大，融合蛋白酶也可容易地通过简单的凝胶过滤方法由成熟蛋白中除去。

根据本发明的第一方面，提供一种双功能融合蛋白酶，其包含小RNA病毒3C蛋白酶和XaaProDAP的催化结构域。在一个实施方案中，双功能融合蛋白酶包含小RNA病毒3C蛋白酶和XaaProDAP。

根据本发明的第二方面，提供一种双功能融合蛋白酶，其包含下式的蛋白：

X-Y-Z　(I)　　或　　Z-Y-X　(II)

其中

X是小RNA病毒3C蛋白酶或其功能变体；

Y是任选的接头；

Z是Xaa-Pro-二肽基氨肽酶(XaaProDAP)或其功能变体；

其中所述融合蛋白酶实质上不具有能够损害两种蛋白水解活性中的至少一种的自我切割活性。

在一个实施方案中，本发明的双功能融合蛋白酶具有式(I)，即所述小RNA病毒3C蛋白酶或其功能变体位于所述双功能融合蛋白酶的N-末端部分。

在另一个实施方案中，X是人鼻病毒14型3C蛋白酶(HRV143C)或其功能变体。

在另一个实施方案中，Z是E.C.3.4.14.11酶或其功能变体。