[发明专利]获得视网膜祖细胞、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的方法

权利要求书

1.一种用于在体外获得人类视网膜祖细胞的方法，包括以下步骤：（i）将人类诱导多能干细胞的贴壁培养物放置于：贴壁培养系统中，所述贴壁培养系统由经丝裂霉素-C失活的小鼠MEF滋养层组成；和促神经培养基中，其中，所述促神经培养基缺乏FGF2并由补充有培养基补充物的营养培养基构成，且其中所述培养基补充物为转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺和亚硒酸钠的混合物；其中，所述多能干细胞形成集落型单层；以及（ii）使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构，其中，步骤（ii）进行至少7天。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述促神经培养基缺乏以下分化因子中的至少一种：头蛋白、Dkk-1和IGF-1。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述促神经培养基缺乏头蛋白、Dkk-1和IGF-1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（i）中，所述集落型单层达到至少80%细胞覆盖。

5.一种用于在体外获得视网膜色素上皮细胞的方法，其中，所述方法包括以下步骤：（i）将人类诱导多能干细胞的贴壁培养物放置于：贴壁培养系统中，所述贴壁培养系统由经丝裂霉素-C失活的小鼠MEF滋养层组成；和促神经培养基中，其中，所述促神经培养基缺乏FGF2并由补充有培养基补充物的营养培养基构成，且其中所述培养基补充物为转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺和亚硒酸钠的混合物；其中，所述多能干细胞形成集落型单层；以及（ii）使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构，其中，步骤（ii）进行至少7天；（iii_RPE）从在步骤（ii）中获得的培养物收集至少一个色素细胞；以及（iv_RPE）培养在步骤（iii_RPE）中获得的色素细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在贴壁培养系统中进行步骤（iv_RPE）中的培养。

7.一种用于在体外获得神经视网膜细胞的方法，其中，所述方法包括以下步骤：（i）将人类诱导多能干细胞的贴壁培养物放置于：贴壁培养系统中，所述贴壁培养系统由经丝裂霉素-C失活的小鼠MEF滋养层组成；和促神经培养基中，其中，所述促神经培养基缺乏FGF2并由补充有培养基补充物的营养培养基构成，且其中所述培养基补充物为转铁蛋白、胰岛素、孕酮、腐胺和亚硒酸钠的混合物；其中，所述多能干细胞形成集落型单层；以及（ii）使所述培养物保持在所述促神经培养基中，直至出现色素细胞和/或神经上皮样结构，其中，步骤（ii）进行至少7天；（iii_NR）从在步骤（ii）中获得的培养物，收集来自至少一个神经上皮样结构的细胞；以及（iv_NR）培养在步骤（iii_NR）中获得的细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（iii_NR）中收集至少一个神经上皮样结构。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，在非贴壁培养系统中进行步骤（iv_NR）中的培养。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（iv_NR）中，在至少5天中向培养基中补充FGF2。

11.根据权利要求7所述的方法，其中，在摇动的条件下进行步骤（iv_NR）中的培养。

12.根据权利要求7所述的方法，用于获得光感受器前体，其中，步骤（iv_NR）进行至少21天。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，在步骤（iv_NR）中，在至少1天至5天中，向培养基中添加缺口抑制剂。