[发明专利]用于操作和成像显微样本的方法和光学布置

说明书

本发明涉及一种方法，其中用操作光操作样本，并且其中借助于SPIM技术在用呈照明光片的形式的照明光、特别是用于荧光激发的激发光照明下成像样本。方法的特征在于，操作光和照明光都由布置在物镜工作位置的相同物镜或由相继被带到物镜工作位置的不同物镜聚焦；并且在穿过物镜之后，操作光和/或照明光借助于转向装置以这样的方式转向使得它相对于物镜的光轴成不同于零度的角传播。

技术领域

本发明涉及一种方法，其中用操作光操作样本，并且其中借助于SPIM技术在使用呈照明光片的形式的照明光(特别是用于荧光激发的激发光)的照明下成像样本。

此外本发明涉及一种光学布置，其用于操作样本并且用于借助于SPIM技术在使用呈照明光片的形式的照明光(特别是用于荧光激发的激发光)的照明下成像样本。

背景技术

在其中进行分层照明样本的SPIM技术(单平面照明显微术)允许更快速地感测图像数据并且例如比样本的斑型扫描样本影响更小。SPIM技术的应用的一个已知领域是荧光显微术的领域，样本中的荧光团用激光激发。在SPIM技术中，激发仅仅发生在照明光片(也称为“光条”)中。由此避免由其它平面中的照明光产生的样本的损伤。

在DE 102 57 423 A1中描述了根据SPIM方法操作的光学装置。使用该显微法，用细光条照明样本，同时垂直于照明光条的平面发生观察。照明和检测在这里经由两个独立的光束路径发生，每个光束路径具有独立的光学器件，特别是具有彼此垂直的两个独立物镜。光条由照明物镜并且由放置在它前面的圆柱形光学器件生成。为了图像采集，样本移动通过相对于检测器静止的光条，以便使用平面检测器分层采集荧光和/或散射光。由此获得的层图像数据然后可以组合成对应于样本的三维图像的数据集。该文献未公开样本的操作。

DE 20 201 110 077 U1公开了一种用于在SPIM显微术的背景下照明样本的布置。该布置包括用于生成光束的光源，用于从光束生成光条的装置，以及至少一个物镜，所述至少一个物镜包括具体化为并且旨在将来自样本的检测光直接地或间接地输送到检测器的光学器件。此外该布置包括位于物镜的光学器件后面、用于转向光条的转向装置。

SPIM技术和光学样本操作的组合在原理上是很吸引人的，原因是具有低样本影响的很快的SPIM技术很好地适合于观察特别是较大的、活的有机物的操作的效果。

从DE 10 2007 047 464 A1已知可用附加的操作光源，其操作光经由透镜布置和反射镜布置经由照明物镜耦合到照明光束路径中。替代地，相同文献附加地提出借助于双色镜将操作光耦合到检测光束路径中，并且通过检测物镜将它引导到样本上。

在该类型的一个操作光经由照明光束路径并且经由检测光束路径输送到样本的实施例中，三个分束器和两个光阑必须费力地插入光束路径中。该设置的优点在于可以从两个方向发生操作。在另一方面，这导致复杂的光学配置并且至少在照明侧导致光损失。

科技出版物“Selective plane illumination microscopy techniques indevelopmental biology”，Huisken等人，Development 136，1963-1975(2009)，公开了一种该类型的装置，其中附加地提供其光经由检测物镜聚焦到样本上的光操作激光器。从“Three-dimensional laser microsurgery in light-sheet based microscopy(SPIM)”，Engelbrecht等人，Optica Express 6420，Vol.15，No.10(2007)，获知很相似的布置。Yanik等人的文章，“Technologies for Micromanipulating,Imaging,and Phenotyping SmallInvertebrates and Vertebrates”，Annu.Rev.Biomed.Eng.2011；13:185-217，也公开了类似的装置和方法，其中样本通过毛细管被泵送。

发明内容