[发明专利]使用绵羊B细胞产生抗体的方法及其用途

说明书

本专利申请在B细胞培养领域中。本文报道了这样的培养系统，其用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbolmyristateacetate)存在的情况下刺激和扩增绵羊来源的分泌抗体的细胞，诸如活化的B细胞、成浆细胞以及分离自免疫的绵羊的B细胞。

发明背景

已经报道，来自不同物种的分离的B细胞、成浆细胞和浆细胞难以在体外进行培养。实践中，这通常通过将原代B细胞与杂交瘤伴侣融合生成永生的B细胞系或永生化来克服。对于兔，还开发了浆细胞瘤融合伴侣(Spieker-Polet,H.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)9348-9352)，但杂交瘤技术在兔中不能很好地运行。对于绵羊，也已经描述了杂交瘤技术(参见例如Osborne,J.,等人,Hybridoma18(1999)183-191)，但这些杂交瘤倾向于不稳定且具有不良产率。对于B细胞在体外的持续存活，必需提供必要的活化刺激和存活因子。已经描述了多种化合物，诸如IL-2、IL-4、IL-10和其他(参见例如Zubler,R.,等人,Eur.J.Immunol.14(1984)357-363,和J.Exp.Med.160(1984)1170-1183)。

在生理学上，B细胞在遇到特异性抗原加上额外活化之后，例如经由CD40/CD40L途径(综述于Néron,S.,等人,Arch.Immunol.Ther.Exp.59(2011)25-40)和/或经由源自天然背景的细胞因子和/或生长因子，例如通过树突状细胞或T细胞辅助之后被活化。

在体外系统中，可以通过与EL4-B5胸腺瘤细胞的共培养或添加可溶性的或固定化的抗CD40抗体或CD40L来模拟CD40/CD40L的相互作用。仅有的系统缺少足够的效力并且仅描述了与使用不同饲养混合物(例如Zubler混合物;IL-4,IL-10,等)(Zubler,R.,上文)或胸腺细胞上清液(TSN)的进一步所需刺激剂的组合。

Weitkamp,J-H.,等人,(J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)报道了从用荧光病毒样颗粒选择的单抗原特异性B细胞生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。产生针对多种同源抗原的多种分离抗体的方法报道于US2006/0051348中。用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法报道于US2007/0269868中。用于制备免疫球蛋白文库的方法报道于WO2007/031550中。

Griebel,P.J.,等人报道了克隆未转化的绵羊B细胞(J.Immunol.Meth.237(2000)19-28)。Griebel,P.,等人报道了CD40信号传导诱导了对γ链-常见的细胞因子家族的多个成员的B细胞响应性(Int.Immunol.11(1999)1139-1147)。Miyasaka,M.和Dudler,L.报道了绵羊未成熟的B细胞在暴露于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯之后的分化(Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.74(1984)281-283)。Miyasaka,M.,等人报道了绵羊中B淋巴细胞的分化：I.回肠淋巴集结细胞的表型分析和回肠淋巴集结中的sIg+细胞的前体群体的证明(Immunol.53(1984)515-523)。Sedgmen,B.J.,等人报道了优化分泌绵羊抗体的细胞测定用于检测外周血白细胞中的抗原特异性免疫球蛋白产生(Immunol.CellBiol.81(2003)305-310)。

发明概述

本文报道了用于从绵羊B细胞开始快速、有效且可重复地生成绵羊抗体且包括至少一个培养步骤的新方法。

本文进一步报道了佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)作为添加剂用于培养绵羊B细胞以提供高效的绵羊B细胞刺激和培养系统的用途。

如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起培养绵羊B细胞的方法。

如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)、绵羊TSN和饲养细胞一起培养绵羊B细胞的方法。

如本文报道的一个方面是用于在佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)存在的情况下/与佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)一起共培养绵羊B细胞和饲养细胞的方法。