[发明专利]噬菌体

说明书

本发明提供了靶向的噬菌体‑聚合物复合物，其包含重组的靶向噬菌体和阳离子聚合物。复合物具有净正电荷。本发明提供了制备噬菌体和其复合物的方法，以及在各种基因治疗应用中用于转基因递送的它们的用途。

本发明涉及噬菌体，并且特别地涉及新的噬菌体复合物。本发明延及制备噬菌体和其复合物的方法，并且涉及在各种基因治疗应用中用于转基因递送的它们的用途。

系统给药后，向体内期望靶位点的转基因的成功递送将会对药物的实践，特别地对基因治疗的进展，基因成像和DNA疫苗应用具有主要影响。而且，向患病组织进行的靶向系统基因递送具有“治疗诊断学”的有效和更安全的方法，即，基因治疗和基因成像两者结合为单矢量系统。使用真核病毒，诸如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和慢病毒属，至今已经取得了基因递送的最大进展，这些真核病毒提供了优良的基因递送载体。然而，使用这些真核病毒的系统给药已经具有有限的成功，由于它们被肝脏和网状内皮系统的不期望的摄取、插入突变、与补体或预存在的抗体进行反应而产生的免疫原性以及对哺乳动物组织的广泛嗜性。

噬菌体(即，细菌病毒)作为用于转基因的靶向系统递送的安全载体已经吸引了关注，因为它们对哺乳动物细胞受体不具有内在的嗜性，但是可以被修饰以在它们的外被蛋白上展示组织特异性配体，而不会有它们病毒结构的破坏。由于大量有希望的特征，这种载体比动物病毒载体和现有的基因递送系统具有许多优点。例如，噬菌体是纳米尺寸的自然系统，其能够有效地凝聚和包装DNA。对噬菌体外被蛋白突变的高耐受性允许外源肽插入到它们的衣壳外被中，这样它们可以靶向期望的细胞类型，而不需要排除对细菌的天然嗜性。此外，在成人和儿童中，噬菌体是安全的，其早就在预防上使用和用于细菌感染的治疗，没有正在确定的安全问题。食品和药物管理局(US-FDA)也已经批准它们用作安全的抗菌食品添加剂。噬菌体载体的大规模生产和纯化是简单和经济的。最后，它们具有外源DNA插入的巨大能力。

最近，发明人介绍了改进版本的基于M13噬菌体的载体，其将来源于腺伴随病毒2(AAV2)的末端反向重复(ITRs)侧翼的哺乳动物转基因盒子掺入到在相容位置的噬菌体基因组中。与系统给药后具有体内长期基因表达的常规噬菌体载体比较，该载体显示了优良的基因递送。为了证明该改进的噬菌体在体内的效力，使用展示了环状RGD4C(CDCRGDCFC)肽配体的噬菌体靶向肿瘤中发现的超量表达的α_v整联蛋白受体。在USA国家癌症研究院所指导下进行的最近研究已经极好地确认了这种噬菌体技术的潜力。靶向的RGD4C噬菌体用于向宠物狗中诊断的癌症递送细胞因子、肿瘤坏死因子-α(TNFα)。重复的剂量证明了安全性，并且引起靶向肿瘤中TNFα的有效表达，导致一些个体中侵袭性肿瘤的完全根除。相应地，噬菌体是已经被实验地表明在体内系统给药后，向靶组织提供安全和有效的转基因递送的第一系统。

然而，不幸地，噬菌体颗粒是比较差的载体，因为它们已经进化只感染细菌，并且不像真核病毒，噬菌体没有向哺乳动物细胞递送基因的内在策略。因此，因为该固有的限制，如果它们将要发现广阔的临床应用，来源于噬菌体的载体需要被改进。因此，需要提供改进的基因递送系统，其有效地和特异地向体内目的细胞递送转基因。

发明人已经研发了包含阳离子聚合物和噬菌体(例如，M13)的新杂合载体系统，已经对其进行基因工程改造以展示肿瘤靶向的配体，并且以携带转基因盒子。

因此，一方面，提供了靶向的噬菌体-聚合物复合物，其包含重组的靶向-噬菌体和阳离子聚合物，其中复合物具有净正电荷。

如实施例中所讨论的，发明人已经惊奇地证明温育重组噬菌体和阳离子聚合物引起新的靶向噬菌体-聚合物复合物(或“杂合体”)的形成，该复合物在生理学pH下具有净阳电荷，例如，当系统地给药时，这显著地和出乎意料地增强了噬菌体进行靶向特异的细胞转导的能力。因此，本发明的噬菌体-聚合物复合物提供了新的杂合载体平台，用在广泛范围的基因治疗应用中，例如癌症治疗中。

将要理解，噬菌体是病毒(即，噬菌体)，其在细菌内感染和复制。使用噬菌体作为基因递送载体的优点是与其它常规病毒相反，它们不自然地感染非细菌细胞，诸如哺乳动物细胞，除非基因修饰它们以特别地这样做以外。