[发明专利]微小RNA病毒蛋白的增强表达

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请流水号61/790,114的优先权。其内容在此完整并入用于所有目的。

对序列表的交叉引用

本申请通过提及并入2013年3月14日创建的名称为“NOVV_52_SeqList.txt”的24kb序列表的内容。

发明背景

人和动物患有由病原体(如细菌、真菌和病毒)引起的疾病和病症。使用疫苗来诱导针对病原体感染的免疫是本领域中公知的。在历史上已经使用多种方法来制备疫苗，包括杀死的病毒和活减毒疫苗。然而，杀死的病毒和活减毒病毒可以与不利效应有关，在一些情况中，杀死的病毒不是有效的或者实际上可以恶化疾病。

疫苗生产的效率也可以是商业生存能力的障碍。在一些情况中，如生产疫苗前需要的长订购前置时间(leadtime)以及在其它情况中在灭活前制备活病毒可以导致疾病和病症。例如，口蹄疫病毒(FMDV)是细小RNA病毒科(Picornaviridae)内的原型口蹄疫病毒属(aphthovirus)。口蹄疫爆发的经济损失是所有家畜疾病的最高者之一，并且广泛的疫苗接种是疾病控制的优选方法。目前的疫苗是杀死的全病毒疫苗，其具有公认的限制，如通过在灭菌前培养活病毒、一些毒株的不良生长、和贮存后免疫原性降低造成的那些。参见Porta等,”Efficientproductionoffoot-and-mouthdiseasevirusemptycapsidsininsectcellsfollowingdownregulationof3Cproteaseactivity,”JVirolMethods.2013Feb；187(2):406-12.)。

在最近几年中，使用重组技术来生成亚基疫苗已经特别有吸引力。然而，虽然重组方法克服了关于生产活疫苗的问题并且提供了快速合成的潜力，但是生产合适量的免疫原出于多种原因可以是挑战性的。

发明概述

本公开内容提供了含有与多肽融合的N-端信号肽的融合蛋白。本公开内容还提供了通过使用N-端信号肽增强多肽生产的方法，特别是在蛋白质既不是分泌性蛋白质又不是跨膜蛋白质的情况下。可以使用融合蛋白来诊断疾病并且诱导免疫应答。在一些方面，多肽是免疫原性的。免疫原性多肽可以来自病毒、细菌或真菌。

附图简述

图1显示了含有FMDVP1蛋白(显示为“vp1-4”)(其是未切割的前体多蛋白，其按次序具有vp0-vp3-vp1，vp0含有vp4和vp2)的BV1168(编码SEQIDNO:4)和BV1169(编码SEQIDNO:1)的质粒图。序列是相同的，只是BV1169含有来自甲型/印尼/5/05流感病毒的血凝素信号肽。

图2A-2D显示了与在缺乏信号肽的情况下表达的相同多肽相比在使用HA信号肽时获得的增强的表达。制备质粒，如图1中描绘。BV1168含有具有六组氨酸标签(His6)的FMDVP1蛋白。BV1169含有FMDVP1蛋白，其具有六组氨酸标签(His6)以及还有来自甲型/印尼/5/05HA的N-端信号肽(SEQIDNO:3)。在Sf9细胞中表达质粒，并且通过SDS-PAGE和Western印迹分析。各道如下：M-标志物。第1-3道显示了自BV1168表达的FMDVP1蛋白，具有六组氨酸标签，没有信号肽。第4-6道显示了自BV1169表达的FMDVP1蛋白，具有六组氨酸标签和信号肽。第7道显示了BV266对照，并且第8道显示了BV1064S300Fxn。根据SDS-PAGE中的总蛋白质染色，图2A在第4-6道中显示了增强的表达。图2B-D在第4-6道中显示了通过抗组氨酸抗体(图2B；“抗HISMab”)，抗FMDVvp2抗体(图2C；“F1412SAMab”)及通过抗FMDVvp1抗体(图2D；“12FE9.2.1AMab”)检测的增强的表达。

图3显示了个别非分泌性蛋白质的增强的表达，其通过在有信号肽的情况下表达它们而实现。用表达具有和没有信号肽的重组蛋白的杆状病毒感染Sf9细胞。在感染后70小时收获细胞。通过使用对重组蛋白特异性的单克隆抗体的Western印迹分析收获的粗制材料(即细胞和培养基)。图面(a)，左图面显示了FMDVvp0的表达。图面(b)，右图面显示了FMDVvp1蛋白的表达。“+”重组蛋白含有信号肽，“-”重组蛋白没有信号肽。