[发明专利]稳定的人单CD4结构域和融合蛋白

说明书

本发明提供了包含单结构域CD4的多肽以及包含所述单结构域CD4和一种或多种融合伴侣的融合蛋白。还提供了编码所述多肽或融合蛋白的核酸，以及包含所述多肽、融合蛋白或核酸的组合物或细胞。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请第61/791,885号的权益，该临时专利申请通过引用并入。

序列表

随本文同时提交的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文。

发明背景

CD4为在大多数胸腺细胞和成熟的T细胞亚群(CD4⁺T细胞)的表面表达的非多态性跨膜糖蛋白(参见Germain,Curr.Biol.,7:R640-R644(1997))。它由四个免疫球蛋白样细胞外结构域、跨膜区段和与src-家族酪氨酸激酶Lck非共价缔合的胞质尾区组成。作为免疫系统的重要组分，CD4起到帮助CD4⁺T细胞上的T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上的II类主要组织相容性复合物(MHCII)更强缔合的共受体的作用。该缔合足以触发T-细胞信号转导，从而导致CD4⁺T细胞的活化。

CD4也经由其激酶连接的胞质尾区通过驱动信号级联来直接促进信号转导。人CD4-鼠MHCII的晶体结构显示仅CD4的第一细胞外结构域(D1)与MHCII接触(参见Wang etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:10799-10804(2001))。然而，突变分析表明除了D1之外，其它结构域也影响与MHCII的结合(参见Moebius等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8259-8263(1993))。而且，CD4的寡聚化对于与MHCII的稳定相互作用以及有效的T-细胞活化是必需的(参见Sakihama et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6444-6448(1995))。

CD4还是HIV-1的主要受体(参见Dalgleish et al.,Nature,312:763-767(1984))。HIV-1进入通过病毒包膜糖蛋白(Env)gp120结合于细胞受体CD4来引发。这一相互作用在共受体(CCR5或CXCR4)参与之后引起gp120以及随后gp41的广泛构象重排。Envs的结构重排以及Envs与细胞受体及共受体的相互作用将病毒膜带向靶细胞膜，并最终引起膜融合和病毒进入。因为CD4在HIV-1感染中起着重要作用，所以含有所有四个(T4)(参见Deenet al.,Nature,331:82-84(1988))或前两个胞外结构域(D1D2)(参见Traunecker et al.,Nature,331:84-86(1988))的重组可溶性表达的CD4(sCD4)为HIV-1进入的有效抑制剂并被用于单独的结晶化(参见Wu et al.,Nature,387:527-530(1997)和Ryu et al.,Nature,348:419-429(1990))或与gp120一起的结晶化(参见Kwong et al.,Nature,393:648-659(1998))。

在Sharma et al.(Biochemistry,44:16192-16202(2005))中，通过使用突变策略生成D1并将其从大肠杆菌的超声处理上清液中纯化。然而，纯化的蛋白质仅在低pH(4.0)下为稳定的，部分错误地折叠，并且具有的亲和力比D1D2或T4所具有的亲和力低数倍。

在Chen et al.(J.Virol.,85:9395-9405(2011))中，鉴别了两种稳定的单体D1突变体，mD1.1和mD1.2，所述突变体比D1D2显著更可溶的并且与Env gp120的结合强于(50倍)D1D2，能比D1D2更有效地中和一组来自不同进化枝的HIV-1原代分离物，诱导gp120的构象变化以及使HIV-1对于通过CD4诱导的抗体中和敏感。