[发明专利]微载体灌注培养方法及其用途

说明书

相关文献的交叉引用

本发明要求申请日为2013年2月22日的美国临时专利申请No.61/768,215的优先权，其全部内容在此通过提述并入。

技术领域

本发明涉及分子生物学方法、细胞培养工艺开发方法以及重组蛋白的制造方法。

发明背景

含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞经常用于生产治疗上或商业上重要的蛋白质。虽然有几种高通量(HT)的细胞培养系统已在生物技术工业中用于补料分批工艺数年，但是没有已知存在的使用摇管和微载体用于基于灌注的细胞培养的HT模型。

以前的使用摇管用于补料分批培养或灌注培养的哺乳动物组织培养方法能在高细胞密度生产重组蛋白；然而，以前的使用摇管和微载体的细胞培养方法已经失败了，这是因为循环的微载体施加于哺乳动物细胞上的剪切应力，其导致细胞生长降低。此外，难以从含有微载体的摇管培养物收取重组产生的蛋白。

发明概述

本发明(至少部分上)基于如下发现，即在以本文描述的具体方式培养哺乳动物细胞(包括使用摇管和多个微载体)导致活跃生长的哺乳动物细胞培养物，所述培养物有效地复制了较大规模的含有微载体的连续灌注生物反应器中实现的重组蛋白生产。因此，本说明书包括了培养哺乳动物细胞的方法，其包括：提供摇管，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据例如约10％至约30％的摇管体积，并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多种微载体；在约32℃至约39℃并伴随约120转每分钟(RPM)至约240RPM(例如约120RPM至约160RPM)的旋转搅拌将所述摇管温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。还提供了多种利用这些培养方法的方法。

本文提供了培养哺乳动物细胞的方法。这些方法包括：提供摇管，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据例如约10％至约30％的摇管体积，并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多种微载体；在约32℃至约39℃并伴随约120转每分钟(RPM)至约240RPM的旋转搅拌将所述摇管温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。在这些方法的一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。在这些方法的一些实施方案中，在所述一段时间的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。在这些方法的任一种的一些实施方案中，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基与第二液体培养基相同。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基与第二液体培养基不同。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇管的容积为约10mL至约100mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞悬浮于约2mL至约20mL的第一液体培养基中。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述一段时间的最初48-96小时后，在每个24小时的时段中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积为第一液体培养基的体积的约30％至约95％。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒的一段时间。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体含有一个或多个孔。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇管以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育。