[发明专利]疫苗

说明书

本文涉及一种具有下列野生型序列的大肠杆菌耐热毒素(ST)的突变体：NSSNYCCELCCNPACTGCY，其中所述突变体包含选自以下的突变：A14H、A14T和N12T。

发明领域

本发明涉及针对肠产毒性大肠杆菌(Escherichia coli) (ETEC)的疫苗。更具体地讲，本发明涉及适宜用作疫苗组分的ETEC耐热肠毒素的突变体。

发明背景

肠产毒性大肠杆菌(ETEC)是一种革兰氏阴性细菌，对每年介于2.8亿和4亿之间的腹泻发作和约38万例死亡负责(Taxt等, Infect Immun. 2010年5月;78(5):1824-31。电子版2010年3月15日)。大多数受害者是生活在发展中国家年龄小于5岁的儿童。另外，ETEC被视为旅行者腹泻的最常见的原因。

ETEC定居于小肠，通过粪便-口腔途径传播。细菌通过特有的定居因子(CF)粘附在肠上皮上。CF是存在于细菌表面的丝状蛋白-菌毛或纤丝。迄今为止，已鉴定出25种不同的ETEC CF(Rivera等, J Clin Microbiol. 2010年9月; 48(9): 3198-3203)。

在开发ETEC疫苗方面已作出了大量努力，但是未获得保护人免于ETEC腹泻的明显有效的疫苗。迄今为止，被杀死的完整细胞疫苗代表了最有前景的候选物(Jertborn等,Vaccine 1998;16:255-60；Sack等, Vaccine, 2007年5月30日;25(22):4392-400. 电子版2007年4月4日)。这包含与重组霍乱毒素B亚基(CT-B)共同给予的5个ETEC菌株。选择5个ETEC菌株以提供最常用的CF。

除CF以外，被称为耐热毒素(ST)和不耐热(LT)毒素的肠毒素是ETEC腹泻中的毒力决定因子。两种毒素通过刺激肠上皮细胞净分泌离子和水而起作用。这引起水性腹泻，其在最极端的情况下可导致霍乱样病况。

在1980年代早期，ST被鉴定为ETEC疫苗的靶标，尽管许多尝试，但都未开发出成功的基于ST的疫苗。

3个主要问题成为将ST用作疫苗组分困难的原因。首先，ST多肽是固有毒性的。其次，ST多肽呈其天然形式时是无免疫原性的。最后，ST密切地类似于内源多肽鸟苷蛋白（guanylin）和uroguanylin，这造成抗耐热毒素抗体可交叉反应的可能性，并在疫苗接种者中引起自身免疫病症。

已报告了几种ST突变体以降低毒性(Taxt, A.等, Infect. Immun.78, 1824-1831 (2010)和Liu, M.等 Toxins3, 1146-1162 (2011)。然而，因为ST是一种小的多肽，大多数毒性降低的突变体的免疫原性也降低。

提供显示降低的毒性和特定免疫原性两者耐热毒素突变体的问题仍然是重大挑战。尽管许多尝试，但仍未开发出诱导中和性和保护性免疫应答的成功的耐热毒素疫苗组分。

发明概述

本发明的一个目的在于提供可以用作ETEC疫苗组分的耐热毒素突变体。具体地说，预期提供显示无毒性或极低毒性且当与合适的载体偶联时能够诱导中和性、特异性免疫应答的耐热肠毒素(ST)的突变体。

为了克服这个问题，进行了所有361个可能的单一点突变型人ST (STh)的系统筛选。突变体与指导蛋白质从宿主细胞中分泌的信号序列一起表达，且表达使用大肠杆菌实验室菌株进行。此实验模型有效模拟天然ST通过ETEC的产生。

在GC-C受体细胞测定法中，使用经过滤的培养物上清液，评价ST突变体文库的毒性。

筛选抗原性作为免疫原性的替代。采用竞争性耐热毒素ELISA测量在兔中针对野生型耐热毒素产生的多克隆抗体与重组表达的耐热毒素突变体结合的程度，来评价抗原性。