[发明专利]微藻生物质蛋白质富集方法

说明书

本发明涉及一种微藻生物质的蛋白质富集的方法，所述微藻更具体地是小球藻属(Chlorella)，甚至更具体地是耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)或原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)物种。

藻类—大型藻和微藻—具有特殊但大多未经开发的丰富性。它们在食物、化学品和生物能源生产中的应用仍极少。然而，它们隐藏着具有巨大价值的组分，只有以其为食的海洋动物才能真正了解这些组分的丰富性和丰度。

事实上，微藻是维生素、脂质、蛋白质、糖、色素和抗氧化剂的来源。

因此，藻类和微藻受到使用它们来生产膳食补充剂、功能性食物、化妆品或药物或进行水产养殖的工业的关注。

最重要的是，微藻是定殖于所有曝露于光的群落生境的光合微生物。

在工业规模上，其单克隆培养是在光生物反应器(自养条件：具有光和CO₂)中进行，或者对于一些微藻，也是在发酵罐(异养条件：在黑暗中在一种碳源存在下)中进行。

事实上，少数微藻物种能在无光下生长：小球藻属、菱形藻属(Nitzschia)、小环藻属(Cyclotella)、四爿藻属(Tetraselmis)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、裂壶藻属(Schizochytrium)。

此外，据估计在异养条件下培养的成本是在光养条件下培养成本的1/10，这是因为对于技术人员来说，异养条件使得以下各项成为可能：

-使用与用于细菌和酵母的发酵罐相同并且容许控制所有培养参数的发酵罐。

-所产生生物质的量显著大于基于光的培养所获得的量。

善用微藻一般需要控制发酵条件以积累所关注组分，例如：

-色素(叶绿素a、b和c、β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素、藻蓝蛋白、黄叶素、藻红蛋白等)，其需求因其显著的抗氧化性质以及在食物中提供天然色彩而日益增加，

-蛋白质，以优化微藻的营养质量；或

-脂质，以优化微藻的脂肪酸含量(以其干物质重量计高达60％，甚至80％)，尤其用于：

·生物燃料应用，以及

·人类或动物食物应用(当所选微藻产生所谓的“必需”(即，因人类或动物无法天然产生而在膳食中提供)多不饱和脂肪酸或PUFA时)。

因此，为获得这种结果，充分研究了第一种高细胞密度(HCD)发酵方法，以获得蛋白质或脂质的最大产率和产量。

这些HCD培养的目标是在最短时间内以尽可能最高的浓度获得所需产物。

例如，针对祖芬氏小球藻(Chlorellazofingiensis)的虾青素的生物合成来验证这个方案，其中证实这些微藻的生长与这种化合物的产生直接相关(王(Wang)和彭(Peng)，2008，世界微生物学与生物技术杂志(WorldJMicrobiol.Biotechnol.)，24(9)，1915-1922)。

然而，维持其生长处于最大速率(μ，以h^-1计)的事实与所需产物的高产量并非始终相关。

事实上，业内专家很快就了解到，为了让微藻产生大储量的脂质，需要例如使这些微藻经受限制其生长的营养压力。

现在，在发酵方法中解除了生长与产量的关系。

例如，为促进多不饱和脂肪酸(本文中为二十二碳六烯酸或DHEA)的积累，专利申请WO01/54510建议解除细胞生长与多不饱和脂肪酸产生之间的关联。

因此，在微藻裂壶藻属株系ATCC20888中，在没有氧限制下进行第一生长期，以促进高细胞密度(大于100g/l)的产生；然后，在第二步骤中，供氧逐步减少，以对这些微藻施加压力，从而减慢其生长并起始所关注的脂肪酸的产生。

在微藻寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)中，以低葡萄糖浓度(约5g/l)且因此具有低生长速率来获得最高二十二碳六烯酸(DHEA，多不饱和脂肪酸)含量，(江(Jiang)和陈(Chen)，2000，生物化学工艺(ProcessBiochem.)，35(10)，1205-1209)。

这些结果明确说明，产物形成的动力学可与微藻生长呈正相关或负相关，甚至呈二者的组合。

因此，在产物形成与高细胞生长无关的情形中，控制细胞生长速率是明智的。

一般来说，技术人员选择通过控制发酵条件(Tp、pH等)或通过控制营养组分向发酵培养基的供应(半连续，所谓的“分批给料”条件)来控制微藻生长。