[发明专利]经修饰的甘氨酸氧化酶

说明书

本发明提供了可用于测量甘氨酸浓度的手段和方法。具体地，本发明提供了经修饰的酶，其中至少一种氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性(例如甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性、甘氨酸氧化酶的热稳定性、和甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性)；以及用于分析甘氨酸的方法，其包括使用经修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸；等等。

技术领域

本发明涉及经修饰的甘氨酸氧化酶、使用该经修饰的甘氨酸氧化酶分析甘氨酸的方法等。

发明背景

已知氨基酸作为活体中的组成是非常重要的，并且一些氨基酸可以变为健康状况的指示物。例如，提示了血浆中的甘氨酸浓度与肥胖症有关(非专利文献1)。甘氨酸是各种食物中天然含有的，并且用作食物添加剂。因此，氨基酸(特别是甘氨酸)的测量在一大批领域(诸如生物学调查、健康营养、医学治疗和食物制造)中具有重要的意义。

使用诸如氨基酸分析仪、高效液相层析(HPLC)或LC-MS等仪器的方法广泛用作分析包括甘氨酸在内的氨基酸的方法。然而，这些仪器是大型且昂贵的，并且需要维护和操作仪器的技术知识和熟练程度，如此其引入、维护和利用需要高成本。还有，由于原则上有必要序贯分析每份样本，分析多份样本花费较长的时间。为了解决这些问题，已经开发出使用催化特定氨基酸的特异性反应的酶来分析氨基酸的方法，并且用于测量一些氨基酸的其试剂盒已经是商品化的。还已经实现了利用酶在电化学或光学上测量特定氨基酸的生物传感器(例如专利文献1，非专利文献2至4)。

已知甘氨酸氧化酶是对甘氨酸起作用的酶(例如非专利文献5)。

现有技术参考文献

专利文献

专利文献1：国际公开文本WO2005/075970

非专利文献

非专利文献1：P.Felig,E.Marliss,G.F.Cahill Jr.(1969)N.Engl.J.Med.281,811-816.

非专利文献2：A.Guerrieri,T.R.I.Cataldi,R.Ciriello.(2007)Sens.ActuatorsB Chem.126,424-430.

非专利文献3：H.Olschewski,A.Erlenkotter,C.Zaborosch,G.-C.Chemnitius.(2000)Enzyme Microb.Technol.26,537-543.

非专利文献4：H.Endo,Y.Hayashi,Y.Kitani,H.Ren,T.Hayashi,Y.Nagashima.(2008)Anal.Bioanal.Chem.391,1255-1261.

非专利文献5：L.Caldinelli,M.Pedotti,L.Motteran,G.Molla,L.Pollegioni(2009)Biochimie 91,1499-1508.

非专利文献6：S.E.Carpenter,D.J.Merkler(2003)Anal.Biochem.323,242-246.

发明内容

本发明要解决的问题

在使用酶的前述氨基酸测量中，期望的是与氨基酸测量有关的酶的特性(例如酶的活性、稳定性和底物特异性)是卓越的。特别对于活性，在要在样本中检测的对象(诸如血液中的氨基酸)的浓度较低时，在底物浓度较低的条件下需要高活性。甘氨酸氧化酶的利用对于分析含有甘氨酸的样本是有希望的，但是它已经是有问题的，即迄今为止已经知道其性质的甘氨酸氧化酶在活性和稳定性上较低(例如非专利文献6)。还有，尚未对许多类型的氨基酸调查底物特异性。如上文描述，不可获得能够实际进行甘氨酸测量的酶。如此，尚未实现使用酶的测量甘氨酸的实际方法或用于测量甘氨酸的试剂盒和生物传感器。