[发明专利]蛋白质的制造方法

说明书

在高效率的蛋白质合成中，mRNA上附着多数的核糖体的多核糖体形成的促进被认为非常地有效，但不清楚p180蛋白质的多核糖体形成的促进功能的结构。本申请的发明人新发现，作为与作为p180蛋白质的多核糖体形成促进功能的责任区域的卷曲螺旋结构域特异性地相互作用的蛋白质、作为促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质的SF3b4蛋白质，然后知，在高表达促进mRNA的小胞体(ER)定位的蛋白质(例如SF3b4蛋白质)和p180蛋白质的两方的细胞中，mRNA的向小胞体上的定位显著地升高，使培养细胞的分泌功能升高变得可能。另外显示，通过在表达质粒中插入特定的核苷酸序列，将有表达蛋白质的增强效果的SF3b4蛋白质在小胞体膜上定位、及使多核糖体中mRNA重量化变动变得可能，经其可增强细胞的分泌能力。

【技术领域】

本申请涉及用于使重组细胞中的自外来性基因的蛋白质的表达亢进的重组细胞、以及涉及利用那样的细胞的发明。更具体涉及，利用使p180蛋白质的表达、及/或SF3b4蛋白质的表达均亢进的细胞、或者有这样的特征的细胞，使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，作为结果提供制造蛋白质的方法。利用有上述特征的细胞，使作为目的物的蛋白质的合成能力或分泌能力亢进，在作为其结果制造蛋白质的方法中，在用于作为目的物的蛋白质表达的载体中利用顺式-元件也作为另外的特征。

【背景技术】

应用基因重组技术的生物技术药品，近年、特别在抗体药品市场急速扩大，向其医疗费的负荷也变得危险，常常要求可相比以往更有效进行蛋白质生产，成本更低的生物技术药品的制造技术的开发。

作为用于利用基因重组技术的蛋白质生产的宿主，至今利用，动物细胞、酵母、大肠杆菌等。大肠杆菌等可以低成本生产作为目的物的蛋白质，但无法进行糖链修饰等的翻译后修饰，在糖蛋白质的生产不适宜。另外，大肠杆菌有易制作含生产的蛋白质的包含体的性质，在作为目的物的蛋白质的取得中，合成后，进一步增溶过程变得必要，存在作业负荷高的缺点。

特别是，抗体等的糖蛋白质的情况中，附加的糖链由于对作为目的物的蛋白质的水溶性、对蛋白酶的抵抗性、组织目标性、还有其生物活性也有影响，必要使用作为高等真核生物的动物细胞的生产技术，近年其技术大大进步。那样的状况的原来、现在的抗体药品的多数在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产，但其制造过程的优化依然是重要的课题。

从含哺乳动物细胞的真核生物细胞向细胞外分泌的蛋白质在作为被内膜隔开的细胞器的小胞体中合成。小胞体被大分为在表面具有由RNA-蛋白质的巨大复合物组成的蛋白质合成装置的核糖体的粗面小胞体和无核糖体的滑面小胞体的2种，但不知粗面小胞体的详细的形成结构。

在活体内，存在专门从事特定的蛋白质的分泌的专门分泌细胞(professionalsecretory cells)，在它们的细胞中粗面小胞体显著地发达，被认为可进行高效率的蛋白质生产。例如分泌胶原的成纤维细胞、分泌消化酶组的胰腺线房外分泌细胞等对应于那样的专门分泌细胞。与这些的专门分泌细胞比较，多用于现在基因工程学蛋白质生产的CHO细胞、HEK293细胞等有粗面小胞体非常地少量，分泌活性低的问题。

在利用基因重组技术生产生物技术药品时，作为目的物的蛋白质的基因在表达载体中显示高的转录活性的启动子的控制化，预计其mRNA以高水平表达。但是，即使置于那样的状况下，也屡屡发生mRNA水平和蛋白质表达量本身不相关的情况，作为其一原因可举在小胞体膜上的翻译效率的低。

即认为，在多用于现在这些的基因工程学蛋白质生产的细胞中，只要可对于在小胞体膜上的翻译装置易利用的形式提供mRNA，就与成纤维细胞的情况同样地，留有可越发增强蛋白质合成能力的余地。

在恒定分泌胶原的成纤维细胞中，编码胶原蛋白质的mRNA时常高水平表达，其大部分在分泌蛋白质的生物合成的场所的小胞体膜上被检测(非专利文献1)。但是，为了使胶原合成活化，仅在小胞体上存在其mRNA是不充分的，使翻译效率高的多核糖体形成变得必要。