[发明专利]含有环状酰亚胺的肽产物的合成

说明书

本发明涉及合成包含至少一个环状酰亚胺基团的肽产物的方法。此外，本发明涉及基本上不含降解产物的包含至少一个环状酰亚胺基团的肽产物。该肽产物可以用作用于质量控制药物肽的参比物质，具体地为用于质量控制GLP‑1激动剂如毒蜥外泌肽的参比物质。

本发明涉及合成包含至少一个环状酰亚胺基团的肽产物的方法。此外，本发明涉及基本上不含降解产物的包含至少一个环状酰亚胺基团的肽产物。该肽产物可以用作用于质量控制药物肽的参比物质，具体地为用于质量控制GLP-1激动剂如毒蜥外泌肽(exendinpeptide)的参比物质。

使用熟知的重组DNA和化学固相合成方法，已经合成了用于制药的若干蛋白和肽。然而这些蛋白和肽的生产通常导致大量不期望的合成副产物。这在它们通过固相合成而产生时尤其如此。随着肽/蛋白长度的增加，导致了合成步骤的增加，这些副产物可占粗产物的50至70％。

副产物可能包括含有环状酰亚胺基团如天冬酰亚胺或戊二酰亚胺的肽产物。这样的环状酰亚胺基团生成于固相合成期间或之后，例如，当从固相载体除去肽时或当配制或存储肽组合物时(Geiger&Clarke,J.Biol.Chem.262(1987),785-794；Hekman et al.,JPharm.Biomed.Anal.20(1999),763-772；Lindner&Helliger,Exp.Gerontol.36(2001),1551-1563；Aswad et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.21(2000),1129-1136；Ritz-Timme&Collins,Ageing Res.Rev.1(2002),43-59；Mergler et al.,J.Pept.Sci.9(2003),36-46；Mergler et al.,J.Pept.Sci.9(2003),518-526:Mergler et al.,J.Pept.Sci.1(2005),650-657；Cebrian et al.,J.Pept.Res.62(2003),238-244；De Boni et al.,J.Chrom.A.1022(2004),95-102；和Houchin et al.,J.Contr.Release 112(2006),111-119)。

含有环状酰亚胺基团的肽产物的靶向合成是未知的。过去，天冬酰亚胺或戊二酰亚胺已经通过“强制降解”方法产生，其中含有氨基酸Asp或Asn的肽经历降解条件，例如在pH 4或pH 8条件下和任选在约40至约50℃的升高的温度下搅拌1-2天。但是，这些方法具有以下缺点：除了所需产物之外，得到了大量的其他降解产物。具体地，环状酰亚胺基团会经历进一步的反应，例如外消旋化，形成异天冬氨酸肽，从Asn转化成Asp，亲核试剂打开天冬酰亚胺，肽键断开，等。因此，在实施强制降解之后，常常难以将所需的环状酰亚胺产物从含肽化合物的复杂混合物中纯化出来。

为了克服这些在制造和纯化环状酰亚胺肽产物中的困难，本发明人研发了用于含环状酰亚胺的肽的靶向合成。

该方法以肽利西拉来(AVE0010)，即一种具有44个氨基酸长度的GLP-1激动剂，作为示例进行显示。利西拉来的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1中：

H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-

G-A-P-P-s-K-K-K-K-K-K-NH₃

利西拉来通过化学固相合成方法来制备。