[发明专利]合成含有乙内酰脲的肽产物

说明书

本发明涉及合成包含至少一个乙内酰脲基团的肽产物的方法。所述肽产物可用作用于质量控制药物肽，具体地用于质量控制毒蜥外泌肽的参比物质。此外，本发明涉及乙内酰脲化学构件、制备所述化学构件的方法以及它们用于合成肽产物的用途。

本发明涉及合成包含至少一个乙内酰脲基团的肽产物的方法。所述肽产物可用作用于质量控制药物肽，具体地用于质量控制毒蜥外泌肽(exendin peptide)的参比物质。此外，本发明涉及乙内酰脲化学构件(building block)、制备所述化学构件的方法以及它们用于合成肽产物的用途。

使用熟知的重组DNA和化学固相合成方法，已经合成了用于制药的若干蛋白和肽。然而这些蛋白和肽的生产通常导致大量不期望的合成副产物。这在它们通过固相合成而产生时尤其如此。随着肽/蛋白长度的增加，导致了合成步骤的增加，这些副产物可占粗产物的50至70％。

用于肽合成的乙内酰脲化学构件的合成来自Zhang et al.,J.Org.Chem.71(2006),1750-1753；Opacic et al.,J.Pept.Res.66(2005),85-93；Vazquez et al.,Chem.Med.Chem.3(2008),979-985；Takeuchi et al.,Chem.Commun.(2000),785-786；Nefzi et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.8(1998),2273-2278；Lamothe et al.,J.Comb.Chem.4(2002),73-78；Chong and Petillo,Tetrahedron Lett.40(1999),2493-2496，以及Park and Kurth,Tetrahedron Lett.41(2000),7409-7413。

上述文件描述了乙内酰脲化合物的固相合成。然而，包含酸-不稳定的经保护的侧链的乙内酰脲的制备是未知的。

本发明描述了由具有经酸-不稳定的保护基团诸如三苯甲基(Trt)、叔丁基(tBu)或丁氧基-羰基(Boc)保护的侧链的二肽合成含有乙内酰脲的肽产物的新的合成。所得的乙内酰脲可包含具有酸不稳定的侧链保护基团的三官能化的氨基酸，或具有完整侧链保护基团的二官能化氨基酸和三官能化氨基酸的组合。

此外，发明人提供了用于制备乙内酰脲的新方法，其在酸-不稳定的载体例如CTC(氯三苯甲基氯)树脂上进行以及例如在三光气的存在下环化。

此外，本申请提供了适于固相肽合成的新的乙内酰脲化学构件以制备具有N-末端乙内酰脲基团的肽产物。

该方法针对肽利西拉来(AVE0010)，即一种具有44个氨基酸长度的GLP-1激动剂进行示例性显示。利西拉来的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1：

H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH₂

利西拉来通过化学固相合成方法产生。

在利西拉来粗产物中，发现了若干含有N-末端乙内酰脲的肽作为副产物。认为它们通过(N-1)酰胺的氮与Fmoc(芴基甲氧基羰基(Fmoc))保护基团的羰基反应而产生，如在图1中所示。在移去芴基甲醇后，形成了包含N-末端乙内酰脲基团的肽产物，从而导致肽合成提早终止。如在图1显示的肽Des[1-12]-乙内酰脲-(13)-AVE0010被鉴定为不能通过色谱操作完全与AVE0010分离的产物。