[发明专利]用于植物的重组蛋白的过度表达的具有最佳的5’(5’-UTR)前导区功能的人工DNA序列和产生植物的重组蛋白的方法

说明书

5’‑UTR前导区的人工DNA，该人工DNA对增加植物的重组蛋白的表达有效，并且，沿5’→3’方向，包含Inr起始位点和Kozak或Kozak样共有序列，并且，还在所述Inr起始位点和所述Kozak或Kozak样共有序列之间包含多个多聚(CAA)区以及与所述多聚(CAA)区数量相同的多个多聚(CT)区，其中，在5’→3’方向，至少一个，任选每个，多聚(CAA)区是多聚(CT)区的上游，并且，在5’→3’方向，至少一个多聚(CAA)区与多聚(CT)区相邻，其中，所述人工DNA没有提供A/T‑富集基序、三核苷酸元件ATT、三核苷酸元件CTG和同聚体片段，即，由超过3个，任选超过4个相同核苷酸组成的序列。

技术领域

本发明关于用于植物的重组蛋白的过度表达的具有最佳的5’(5’-UTR)前导区功能的人工DNA序列和产生植物的重组蛋白的方法。

背景技术

为了改善植物的异源基因的表达有多个可以采用的方法。实际上，组成基因的所有元件对基因表达运用或能够运用控制功能，调节转录和/或翻译过程。位于mRNA的5’端和3’端的非翻译序列(称作5’-UTR和3’-UTR，这里UTR代表“非翻译区”)对此没有例外，并且实际上必须被认为是适当修饰的优先目标，因为，在很大程度上，它们决定mRNA本身的翻译效率和周转(turn-over)。实际上，丰富的证据证明：

-位于mRNA的5’末端的m7Gppp(5’-帽子)结构对募集能够结合核糖体40S亚基的eIF4F复合体是必要的(Franks和Likke-Andersen,2008)；

-通过eIF4G部分，eIF4F复合体与位于mRNA的3’末端的多聚腺苷酸(poly(A))尾反应，允许后者呈现环状结构(Franks和Likke-Andersen,2008)；

-多聚腺苷酸尾和eIF4F复合体减少5’-帽子结构的酶水解，从而防止细胞质核酸外切酶作用在单磷酸5’末端导致mRNA的快速降解(Franks和Likke-Andersen,2008)；

-5’-UTR序列可含有能够影响5’-帽子结构的形成、后者与eIF4E因子的结合、核糖体40S亚基的募集、多核糖体的组成、43S复合体的自发离解速率、真实翻译起始密码子的识别的元件；

-5’-UTR序列还可含有向特异性转录因子的DNA呈现结合位点的序列，从而可以修饰启动子上游的转录活性。

因此很明显，5’-UTR，还称为前导区，在植物工程计划中需要被特别考虑以便增加重组蛋白的表达水平。

但是，由于各种原因，即使对于本领域的技术人员来说，根本不容易设计出高效前导序列。第一，必须考虑在属于相同基因组或相关基因组的不同基因的前导区之间看得见的序列中的巨大的变异性。该变异性使识别能够将改善的特征赋予前导区的潜在片段非常困难，并且尤其是，不可能预测与组成5’-UTR区的其他元件或序列的可能的相互作用。第二，前导区的总长可能必须被包含在100-120bp内，优选80bp，以便不增加来自所述区本身的43S复合体的自发离解的频率。这把实际上将用于前导区片段的结构的成分的严格挑选强加于其他的损害。第三，所述前导区不应含有回文序列或G/C富集的核苷酸组成，以便防止通过eIF4A的介入不能分解的转录物的二级结构的形成。最后，但是无论如何是重要的，序列的小部分(大约10％)不能随意改变，而是必须含有基本功能元件，如，具体地，Inr起始位点和Kozak基序或相当的Kozak样基序。

申请WO 2008/080954描述了5’-UTR序列内重复的CAA元件和重复的CT元件的组合可用来增加植物中重组蛋白的表达。此外，还描述了多聚(CAA)和多聚(CT)与CaMV(即，花椰菜花叶病毒)35S启动子的转录起始位点(Inr)(Guilley等,1982)和/或与来自TMVΩ前导区的ACAATTAC八聚体(Gallie和Walbot,1992)的共存。实际上，WO 2008/080954描述了含有例如所有以上引用的元件的称为LLTCK的前导序列：