[发明专利]从凝结芽孢杆菌中产生部分纯化的细胞外代谢产物的方法及其生物应用

权利要求书

1.用于从益生菌菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)MTCC 5856中产生部分纯化的细胞外代谢物制剂的纯化方法，所述菌株表现出与已知细菌菌株凝结芽孢杆菌ATCC31284、凝结芽孢杆菌NBRC 3887和凝结芽孢杆菌ATCC 7050具有99％遗传同源性，所述纯化方法包括以下步骤：

a.将表现出与已知细菌菌株凝结芽孢杆菌ATCC 31284、凝结芽孢杆菌NBRC 3887和凝结芽孢杆菌ATCC 7050具有99％遗传同源性的凝结芽孢杆菌MTCC 5856接种到1.0升的葡萄糖酵母提取物醋酸盐肉汤培养基或含0.5％tween 80的MRS肉汤培养基或玉米浆干粉培养基中；

b.在37℃，120rpm下在步骤a的接种过的培养基中进行发酵24-48h；

c.在4000-7000rpm下离心步骤b的发酵肉汤；

d.在50℃下通过利用旋转蒸发器浓缩步骤c的上清液10倍；

e.向步骤d的100ml的10倍浓缩上清液中逐滴加入150ml冰冷的丙酮，然后混合；

f.将步骤e的混合物在0℃孵育30分钟，然后在7000-8000rpm下离心；

g.弃去步骤f中获得的沉淀物并收集60％丙酮饱和的上清液200ml；

h.通过旋转蒸发器浓缩步骤g中的丙酮饱和的上清液至50ml；

i.利用4N HCl调节pH至5.0，过滤并在进一步使用之前贮存在-20℃，其中所述过滤步骤使用0.22微米的由印度生产的Millex Millipore；

j.冷冻干燥/喷雾干燥/托盘干燥步骤h的上清液；

其中所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)MTCC 5856保藏于微生物菌种保藏与基因库(Microbial Type Culture Collection and Gene Bank)，并分配菌株号MTCC 5856。

2.一种微生物控制的方法，所述方法包括步骤：将有效浓度的根据权利要求1所述方法制备的部分纯化的细胞外代谢物制剂与靶微生物细胞相接触。

3.权利要求2所述的方法，其中所述微生物细胞是选自包含以下的组中之一：铜绿假单胞菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，变形链球菌，痤疮丙酸杆菌，蜡状芽孢杆菌和阿博尼沙门氏菌。

4.一种微生物控制的方法，所述方法包括步骤：将微生物细胞与有效浓度的基本上由权利要求1所述方法制备的部分纯化的细胞外代谢物组成的制剂和防腐剂共混物相接触，所述防腐剂共混物包括61％w/w的百里酚，38％w/w的甘油一月桂酸酯和获自木兰(Magnolia officinalis)的超临界流浸膏的1％w/w的木兰醇。

5.权利要求4所述的方法，其中所述微生物细胞是选自包含以下的组中之一：铜绿假单胞菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，变形链球菌，痤疮丙酸杆菌，蜡状芽孢杆菌和阿博尼沙门氏菌。

6.一种抑制微生物生物膜形成的方法，所述方法包括步骤：将产生物膜的微生物细胞与基本上由权利要求1所述方法所制备的的部分纯化的细胞外代谢物组成的制剂单独地相接触，或与防腐剂共混物组合的所述制剂相接触，所述防腐剂共混物包括61％w/w的百里酚，38％w/w的甘油一月桂酸酯和获自木兰的超临界流浸膏的1％w/w的木兰醇。

7.权利要求6所述的方法，其中所述产生物膜的微生物细胞是选自包含以下的组中之一：铜绿假单胞菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，变形链球菌。

8.一种在蔗糖存在下防止pH下降并进一步防止变形链球菌的生物膜聚集的方法，所述方法包括步骤：将产生物膜/斑变形链球菌与基本上由权利要求1所述方法所制备的部分纯化的细胞外代谢物组成的制剂单独相接触，或与防腐剂共混物组合的所述制剂相接触，所述防腐剂共混物包括61％w/w的百里酚，38％w/w的甘油一月桂酸酯和获自木兰的超临界流浸膏的1％w/w的木兰醇。