[发明专利]基于蛋白结合的FV文库及其制备方法

权利要求书

1.一种基于蛋白结合来构建包括单个分离的Fv的Fv文库的方法，所述方法包括步骤：

(a)制备在细胞中表达的重链可变区(V_H)结构域蛋白和在细胞中表达的轻链可变区(V_L)结构域蛋白；

(b)在所述细胞外，通过混合V_H结构域蛋白和V_L结构域蛋白，单个拼接步骤(a)制备的V_H结构域蛋白和V_L结构域蛋白以组装成Fv，其中所述拼接选自：(i)野生型结构域之间拼接；(ii)通过在结构域蛋白中引入的半胱氨酸之间的二硫键拼接；和(iii)通过来自卷曲螺旋结构域之间的融合的卷曲螺旋拼接；以及

(c)将在步骤(b)中组装的Fv储存在给予识别号码的单个区室中；其中无需用于与靶标结合的所述Fv的预筛选，分析所述单个区室中的每个Fv的功能。

2.根据权利要求1的方法，其中所述V_H结构域蛋白和V_L结构域蛋白中已引入有所需的多样性。

3.根据权利要求1的方法，其中所述V_H结构域蛋白和V_L结构域蛋白是人源的或非人源的。

4.根据权利要求1的方法，其中向在V_H结构域蛋白或V_L结构域蛋白的CDR(互补决定区)或框架中引入突变。

5.根据权利要求4的方法，其中CDR是CDR1、CDR2或者CDR3。

6.一种筛选具有所需功能的所需的Fv抗体的方法，该方法包括步骤：

(a)根据权利要求1至5中任一项的方法，基于蛋白结合构建Fv文库；和

(b)使用该Fv文库对于所需的性质、特征或活性进行单个成员功能性分析。

7.根据权利要求6的方法，其中所需的性质、特征或活性是细胞增殖、分化或细胞死亡。

8.根据权利要求6的方法，进一步包括步骤(c)：鉴定其中储存有所需Fv抗体的区室的识别号码。

9.根据权利要求8的方法，进一步包括步骤(d)：鉴定在步骤(c)中已被识别的区室的Fv抗体的V_H结构域蛋白和V_L结构域蛋白。

10.根据权利要求8的方法，进一步包括步骤(d)：鉴定从已被识别的区室中分离的Fv抗体的序列。

11.一种Fv文库，所述Fv文库包括单个与V_L结构域蛋白配对以形成组装的Fv的V_H结构域蛋白，其中所述V_H结构域蛋白在细胞中表达且V_L结构域蛋白在细胞中表达，通过混合V_H结构域蛋白和V_L结构域蛋白，使所述V_H结构域蛋白和所述V_L结构域蛋白在所述细胞外配对，其中所述配对选自：(i)野生型结构域之间拼接；(ii)通过在结构域蛋白中引入的半胱氨酸之间的二硫键拼接；和(iii)通过来自卷曲螺旋结构域之间的融合的卷曲螺旋拼接，

其中所述组装的Fv各自储存在指定具有识别号码的单个区室中，

其中无需用于与靶标结合的所述Fv的预筛选，分析所述单个区室中的每个Fv的功能。

12.根据权利要求11的Fv文库，其中向在V_H结构域蛋白或V_L结构域蛋白的CDR(互补决定区)或框架中引入突变。