[发明专利]自养培养

说明书

技术领域

本发明涉及包括细胞的自养培养的方法。

背景技术

在发酵制备产物的情况中，总是努力尽可能避免不希望的副产物的形成或使其减少至最小。通常，可以由此增加产物收率，并且也可以简化终产物的纯化。

使用无机碳作为碳源以合成有机分子的细胞尤其以爆鸣气细菌和产乙酸生物的形式已知。

产生聚羟基烷酸酯的生物使用3-羟基烷酰基(alkanyl)-辅酶A作为前体。该代谢产物可以充当出色的起始物质，以尤其也通过人工插入的代谢途径代谢成另外的高价值的有机物质。

具体地，近年来已经详细表征和研究了爆鸣气细菌钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）。

在Vollbrecht等人, Excretion of Metabolites by Hydrogen Bacteria I. Autotrophic and Heterotrophic Fermentations, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6, 145-155 (1978)中，分析了不同钩虫贪铜菌菌株的副产物形成。

本发明的目的是，提供一种在发酵法中减少副产物形成并从而增加在生物合成中减少的聚羟基烷酸酯的单体单元的收率的方法。

发明内容

已经令人惊奇地发现，在下文中描述的方法能够达到所述的目的。

因此，本发明提供了一种方法，其中已经在自养条件下进行特别用于产生细胞团的预培养，继之以进一步的自养培养，其优选至少经过培养的部分时间范围用于产物形成。

本发明的一个优点在于，明显减少形成不希望的副产物，例如乙酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、丙氨酸、缬氨酸、丁醇、丁酸盐、苹果酸盐、丙酮、2-甲基丙酸或3-甲基丁酸盐，特别是乙酸盐、丙酮酸盐和丙酮。

因此，本发明有利地增加空间-时间收率。

本发明的另一个优点是，可以更容易地分离期望的产物。

本发明的另一个优点是，可以完全独立于复杂的碳源（例如，糖）来进行。

本发明的另一个优点是，二氧化碳被结合，否则其可作为温室气体而产生问题。

根据本发明的方法包括以下方法步骤：

A) 在自养条件下在培养基中繁殖细胞直到X个细胞/升的细胞密度，所述细胞已如此进行了遗传修饰，以至于它们具有与它们的野生型相比减少的聚羟基烷酸酯合成，

B) 在培养基中将所述细胞的至少一部分稀释至0.001 X至0.5 X、优选0.01 X至0.3 X、特别优选0.1 X至0.2 X的细胞密度，和

C) 在自养条件下繁殖所述细胞的至少一部分。

在本发明上下文中的术语“在自养条件下”应当被理解为是指这样的培养条件：其中基于碳原子计，细胞可利用的碳源含有至少90重量%的无机碳。

细胞的“野生型”优选表示这样的细胞：其基因组以天然方式通过进化产生的状态存在。该术语用于全细胞和单个基因。因此，术语“野生型”特别地不包括这样的细胞或基因：其基因序列已经借助于重组技术至少部分地被人工修饰。

在本发明上下文中的术语“与野生型相比减少的聚羟基烷酸酯合成”应当被理解为是指，当在与野生型相同的条件下培养时，所研究的细胞每个细胞形成与野生型相比更少的聚羟基烷酸酯。

除非另有说明，给出的百分比(%)是质量百分比。

在根据本发明的方法中使用的细胞是遗传修饰的细胞，因此是重组细胞。它们可以是原核生物或真核生物。它们可以是哺乳动物细胞(诸如人细胞)、植物细胞或微生物诸如酵母、真菌或细菌，其中微生物是特别优选的，且细菌和酵母是最优选的。根据本发明优选的是，使用的细胞选自产乙酸细菌或爆鸣气细菌。

术语“爆鸣气细菌”应当被理解为是指这样的细菌：其能够化能自养生长，且能够在氧存在下由H₂和CO₂构建具有超过一个碳原子的碳骨架，其中氢被氧化且氧被用作末端电子受体。根据本发明，可使用这样的细菌，其天生就是爆鸣气细菌或者已经通过遗传修饰变成爆鸣气细菌的细菌，例如通过必要酶的重组插入，已经能够在氧存在下由H₂和CO₂构建具有超过一个碳原子的碳骨架的大肠杆菌细胞，其中氢被氧化且氧被用作末端电子受体。优选地，在根据本发明的方法中使用的爆鸣气细菌是作为野生型已经是爆鸣气细菌的那些。