[发明专利]生物物质的实时定量及定性分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物物质的实时定量及定性分析方法，尤其涉及在同一个空间内合并进行实时聚合酶链反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)及DNA微阵列而能够进行生物物质的实时定量及定性分析的方法。

背景技术

当前在分子诊断中广泛施行的分析物质的靶基因检查方法大体上有定量方法(quantitative method)和定性方法(qualitative)。

定量方法是相对地测量或者绝对地测量靶基因的表达程度和基因个数(copy number)的方法。另一方面，定性方法是分析靶基因的存在与否以及基因型(genotyping)的方法。

作为定量检查的方法有利用实时PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)的方法。利用实时PCR的检查方法具有能够进行定量分析的优点，而且利用实时PCR的检查方法可在试剂混合之后不开封试管的情况下获得基因扩增信号，从而具有能够减少由空气引起的污染危险的优点，因此被广泛使用。然而，难以进行在一个试管内可同时确认的荧光数量为最多6个不同种类以上，因而在需要检查数十个基因变异和基因型的领域的情况下，存在需要分配多个试管来进行检查的难点。

作为定性检查的对靶的方法有利用DNA微阵列的方法。对于利用DNA微阵列的检查方法而言，在表面固定多个靶探针，从而具有一次用一个种类的荧光能够检查多样的基因型的优点，然而却存在不能进行定量分析的局限性。

最近，正在研究弥补这样的定性检查或定量检查的缺点的定量及定性检查方法。作为这种研究的环节开发出了如下种技术，即，在一个容器内以实时PCR进行定量分析，并将扩增的基因与固定于同一容器的固体底面的探针进行反应，由此使多重分析变为可能。然而，对于所述技术而言，存在为了获取探针信号，在开封容器或清洗容器后，需要利用专门的扫描器读取信号的局限性。

作为现有技术有韩国公开专利公报第10-2010-0102560号(2010.09.24.公开)，在上述文献中公开有实时核酸分析合并装置及利用该装置的靶核酸的检测方法。

发明内容

技术问题

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可从固定有探针的生物芯片同时进行反应产物的定量及定性分析的方法，所述探针用于对在单一反应容器内利用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)而被扩增的反应产物进行定量和定性分析及鉴别靶基因。

技术方案

根据本发明的一方面可提供一种生物物质的实时定量及定性分析方法，包括如下步骤：(a)准备生物物质检测用元件，该生物物质检测用元件包括上部形成有开口部的反应容器和通过所述开口部而可装卸于所述反应容器的元件部，其中所述元件部包括结合于所述反应容器的开口部的盖和朝所述盖的下部延伸而形成的杆，所述杆具有表面固定有第三探针的生物芯片；(b)向所述反应容器内添加包含第一探针-第二探针复合体、正向引物、反向引物、碱磷酸去氧核苷酸(dNTP，deoxynucleotide triphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含靶基因的样本及缓冲溶液的反应溶液，其中，所述第一探针包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能够产生第一荧光信号的第一荧光体和能够猝灭所述第一荧光体的第一猝灭体，所述第二探针包含互补于所述第三探针的寡核苷酸序列，而不包含互补于所述样本内靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是为了扩增所述样本内靶基因而包含互补于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；(c)进行包含所述样本内靶基因的变性反应、所述样本内靶基因和所述复合体、所述正向引物及所述反向引物的杂化反应以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延长反应的聚合酶链反应，其中，通过所述杂化反应而仅在所述靶基因和所述复合体中的所述第一探针之间进行杂化反应，在进行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延长反应的期间，从所述复合体分解并释放所述第二探针及所述第一荧光体；(d)被释放的所述第二探针和固定于所述生物芯片的所述第三探针进行杂化之后通过所述聚合酶而所述第二探针在所述第三探针上延长，其中，所述第三探针包含能够产生第二荧光信号的第二荧光体和能够猝灭所述第二荧光体的第二猝灭体，随着所述第二探针在所述第三探针上延长，第二猝灭体从所述第二荧光体分开而产生发光；以及(e)检测由所述第一荧光体引起的第一荧光信号以及由所述第二荧光体引起的第二荧光信号。