[发明专利]人源抗纤连蛋白ED‑B结构域的抗体及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及单克隆抗体技术，噬菌体展示技术，以及基因重组技术，尤其是结合纤连蛋白(fibronectin，FN)的ED-B结构域的抗体或抗体片段。另外本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法及含有该单克隆抗体的药物组合物。

发明背景

常用的肿瘤治疗方式有化疗与放疗，由于这些治疗方法特异性不高，对正常组织产生显著的毒副作用，在杀死癌细胞的同时，影响正常器官的生理功能，降低患者的免疫能力和生活质量。提高肿瘤治疗药物特异性的一个方法是借助可识别肿瘤细胞标志物的抗体或抗体片段将药物靶向到肿瘤细胞，对肿瘤产生有针对性的杀伤。这首先需要找到能在细胞膜外表面表达的肿瘤标志物，即只在肿瘤细胞表面或基质中表达但在正常细胞或组织中表达量很少，甚至不表达的蛋白。

纤连蛋白是一种多功能的糖蛋白,广泛地存在于细胞外基质、血浆及其他体液中，由上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、蜕膜细胞及绒毛外滋养细胞等表达，参与细胞的粘附、变形与分布，及血管的形成。

FN的基因约有75kb，约含50个外显子，主要由I，II，III型三类同源重复单元构成，ED-B是包含在FN的III型重复序列中，由单个外显子编码的包含91个氨基酸的完整重复。在FN基因表达过程中，有含ED-B结构域的FN(B+)和不含ED-B结构域的FN(B-)两种情况，这两种情况被认为在个体发育过程中发挥着重要作用，FN(B+)在成人正常组织中表达量极少,但在创伤、疾病、伤口愈合特别是肿瘤生长过程中又重新高表达,故又称癌胚基因。如胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等细胞中高表达含ED-B结构域的FN(B+)。通过体外免疫组织化学检测和体内靶向定位显示，FN(B+)在多种肿瘤组织血管中高表达，而在成年人的正常组织中不表达，是肿瘤组织的一种标志性蛋白。

因此，基于ED-B结构域开发出靶向抗体，可用于将候选药物如细胞毒素等靶向至肿瘤部位，可有效抑制或杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗目的，并且同时减少对正常组织的伤害，减少毒副作用。

针对ED-B的抗体筛选或药物开发已有20多年的历史。比如通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗BC-1(Carnemolla,Leprini et al.1992)，它可以特异性的识别人新生血管的FN(B+)，而不与FN(B-)发生交叉反应。

另外，通过小鼠免疫和借助噬菌体展示技术的亲和力成熟，获得的Fab形式的鼠源抗体MOR03255，其最高亲和力达到30pM。MOR03255具有中和抗体的特征，通过与ED-B的结合抑制人真皮微血管内皮细胞(HDMVE)与胞外基质的黏附，从而抑制新生血管的形成，使肿瘤组织因缺少血管而营养匮乏，在活体实验中体现出显著的抑制肿瘤生长的效果。

但研究证明，鼠源抗体药物在人体内应用时会产生严重的人抗鼠抗体(HAMA)反应，还可能产生其他副作用，比如变态反应、血液疾病、肾脏受损，另外抗体的半衰期短，影响抗体的治疗效果。因此，鼠源抗体BC-1及MOR03255具有一定的局限性。现在鼠源抗体已逐渐被人源化抗体和全人源抗体代替。

由于人与小鼠ED-B的氨基酸序列100％同源，小鼠免疫系统会将人ED-B当作自身蛋白，难以对人ED-B结构域产生免疫反应，因此针对ED-B的鼠源抗体开发往往事倍功半。现在借助基因工程技术，直接利用噬菌体展示技术表达人工合成的抗体基因，通过筛选获得具有特定功能的抗体，而不需要借助高等动物体的免疫系统产生，具备了开发人源重组抗体技术。目前报导的ED-B人源抗体有CGS-1，CGS-2，L19等(Carnemolla,Neri et al.1996,Pini,Viti et al.1998)，这些抗体均具备了高度的特异性，并且经BIAcore检测，亲和力分别达到5.4×10^-8M，1.1×10^-9M，8.7×10^-10M。尤其是抗体L19的临床研究，充分证明了针对ED-B开发特异性抗体药物，具有显著的抑制或杀伤肿瘤的效果。